Summary

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Published: September 06, 2024
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Summary

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Abstract

Mikroglia, als die ansässigen Makrophagen des Gehirns, sind für die Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns unerlässlich. Sie formen neuronale Schaltkreise während der Entwicklung, untersuchen ihre Umgebung nach Ablagerungen oder abgestorbenen Zellen und reagieren auf Infektionen und Verletzungen im Gehirn, um nur einige Funktionen zu nennen. Ihre wichtige Rolle in der Neuroentwicklung und der synaptischen Plastizität und Pathophysiologie ist jedoch noch nicht vollständig definiert, was den Bedarf an weiteren Untersuchungen unterstreicht. Um ein umfassenderes Verständnis der Rolle von Mikroglia in diesen Prozessen zu erlangen, müssen wir Mikroglia isolieren und sie genetisch, metabolisch und funktionell charakterisieren. Die Isolierung von Mikroglia aus erwachsenen Mäusen, insbesondere aus kleinen Gehirnstrukturen, ist jedoch eine Herausforderung, da sie einen kleinen Prozentsatz der gesamten Gehirnzellen ausmachen und die Ausbeute an isolierten Mikroglia oft zu gering ist. Hier ermöglicht uns die magnetische Isolierung von Mikroglia mit CD11b+ -Mikrokügelchen, Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus eines frisch durchbluteten adulten Mausgehirns zu sortieren. Die derzeitige Methode ermöglicht es uns, in kurzer Zeit eine relativ hohe Reinheit und Ausbeute zu erreichen und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

Introduction

Mikroglia machen 5-20% der gesamten Nervenzellen aus und sind die einzigen Gliazellen, die von erythromyeloiden Vorläuferzellen im Dottersack abstammen und um den embryonalen Tag herum beginnen, das sich entwickelnde Gehirn zu besiedeln E9.5 1,2. Sie sind langlebige Zellen mit der Fähigkeit, sich langsam und unabhängig von Zellen aus dem Knochenmark zu erneuern3. Als einige der hochdynamischsten Zellen sind sie in der Lage, als Reaktion auf Kontext- und Umweltreize verschiedene Phänotypen anzunehmen 2,4. Unter den Signalen, die in der Lage sind, ihre Aktivität zu modulieren, sind die Schädigung des Zentralnervensystems (ZNS), die neuronale Aktivität sowie die Nährstoffe am stärksten. Eine zunehmende Zahl von Forschungsarbeiten hat die zentrale Rolle von Mikroglia bei Verletzungen, neurodegenerativen Erkrankungen und Fettleibigkeit gezeigt 2,5,6. Nichtsdestotrotz bedarf die genaue Rolle der Mikroglia sowohl in physiologischen Prozessen als auch in der Pathophysiologie weiterer Untersuchungen. Daher ist ihre transkriptionelle, metabolische und funktionelle Charakterisierung unter verschiedenen Bedingungen von großer Bedeutung und erfordert ihre Isolierung, da in situ Studien für die DNA-, RNA- und Proteinlokalisierung und qualitative Vergleiche sowie die morphologische Charakterisierung von Mikroglia geeignet sind.

Für die Isolierung von Mikroglia werden verschiedene Techniken beschrieben, darunter die Percoll-Gradientenmethode7, die Durchflusszytometrie-Zellsortierung (FACS)8 und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS). Die Auswahl der geeigneten Methode hängt von den Zielen der Studie und dem für nachgelagerte Anwendungen erforderlichen Reinheitsgrad ab. Die Isolierung reiner Mikroglia aus dem erwachsenen Mausgehirn, insbesondere aus kleinen Hirnstrukturen wie dem Hypothalamus, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung. Die automatisierte sanfte Dissoziation des Hypothalamus mit Hilfe der Miltenyi-Technologie ermöglicht die Aufreinigung einer relativ hohen Mikroglia-Ausbeute in kurzer Zeit mit der Möglichkeit, bis zu acht Proben gleichzeitig mit einem schonenden MACS Octo Dissoziator zu verarbeiten.

Auf die Gewebehomogenisierung folgt die Aufreinigung der Mikroglia mit der säulenbasierten MACS-Technologie und den supermagnetischen CD11b+-Kügelchen in Nanogröße. Daher werden alle Proben auf genau die gleiche Weise verarbeitet, wodurch intakte CD11b+-Zellen erhalten werden. Bemerkenswert ist, dass CD11b nicht ausschließlich in Mikroglia vorkommt, sondern auch auf anderen Zellen der myeloischen Linie, einschließlich Makrophagen und Monozyten, exprimiertwird 9. Um dies zu begrenzen, gewährleistet die Perfusion des Gehirns mit eiskalter Kochsalzlösung vor der Hypothalamusextraktion (siehe Protokollschritt 2.6) die Eliminierung der meisten myeloischen Zellen, so dass nur ein potenziell kleiner Teil der residenten Makrophagen oder derjenigen, die an Blutgefäßen haften, übrig bleibt. Die residenten Makrophagen und Monozyten eines gesunden Steady-State-ZNS machen einen geringen Prozentsatz der gesamten Immunzellen des Gehirns aus (~10% bzw. <2%)10,11. Wenn Gehirnzellen mit CD11b+-Kügelchen sortiert werden, können daher sowohl Mikroglia als auch Makrophagen isoliert werden, obwohl die überwiegende Mehrheit Mikroglia sind.

Die Endausbeute von Mikroglia und die Aufrechterhaltung ihrer Lebensfähigkeit ermöglichen es uns, sowohl ex vivo als auch in vitro Assays durchzuführen, mit dem Vorteil, dass bestimmte Hirnregionen von Interesse analysiert werden können. Die neuesten Erkenntnisse haben gezeigt, dass die Mikroglia-Population sehr heterogen ist und die regionsspezifische Genexpression sowie morphologische Merkmale und Funktionen repräsentiert 2,12,13. Daher zielt das aktuelle Protokoll darauf ab, adulte Mikroglia regionenspezifisch zu isolieren und zu analysieren. In der Tat können wir die genetischen, transkriptionellen und translationalen Profile adulter hypothalamischer Mikroglia mit Methoden wie RT-qPCR und RNA-Sequenzierung sowie mit in vitro-Funktionsanalysen charakterisieren.

Protocol

Alle beschriebenen Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union (2013/63/EU) durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission der Universität Bordeaux (CEEA50) und dem französischen Ministerium für Hochschulbildung, Forschung und Innovation genehmigt (nicht-technische Zusammenfassung des genehmigten Projekts NTS-FR-619193 v.1 vom 23.12.2022). Das folgende Protokoll wird an adulten C57BL/6-Mäusen mit einem Durchschnittsalter von 2-4 Monaten …

Representative Results

Die Bewertung der Endausbeute hängt vom Reinheitsgrad und der Menge der isolierten Zellen ab und kann durch RT-qPCR, Zellzählung und Proteinquantifizierung bestimmt werden. Die Reinheit der isolierten magnetischen Zellen aus dem Hypothalamus wurde durch die Genexpressionsanalyse von CD11b, C1qa, Gad1 und GFAP mittels RT-qPCR bestätigt (Abbildung 1). CD11b und C1qa werden überwiegend von Mikroglia im Steady State exprimiert, CNS16 und Gad1 und GFAP dienen als neuro…

Discussion

Das aktuelle Protokoll stellt die Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundierten adulten Mausgehirnen durch magnetaktivierte Zellsortierung dar. Die oben vorgestellten Ergebnisse bestätigen die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter Zellen sowie die Wirksamkeit dieser Methode zur funktionellen Charakterisierung von Mikroglia ex vivo, z.B. durch phagozytäre Aktivität und Quantifizierung der ROS-Produktion. Klassische Methoden zur Isolierung einer bestimmten Zellpopulation könnten auch f?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AN wird unterstützt vom Institut Universitaire de France (IUF), der Universität Bordeaux, der französischen Stiftung für Hirnforschung (FRC), der GLN (Lipid-Nutrition Group) und der Nationalen Forschungsagentur (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA wurde unterstützt von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon Europe der Europäischen Union im Rahmen der MSCA Doctoral Networks 2021, Nr. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.

Materials

Adult Brain Dissociation Kit Miltenyi 130-107-677 The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A).
Albumin Bovine FrV BSA EuroMedex 04-100-812-C
CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size Miltenyi 130-093-636
CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit Invitrogen C10492
Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL CellTreat 978449
DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate Gibco 14287-072
gentleMACS C Tubes Miltenyi 130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi 130-096-427
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher 78420
Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) Thermofisher 78437
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Thermofisher 14065056
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L3280
LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche  4707516001 This reagent was used to perform PCR. 
MACS SmartStrainers (70 µm) Miltenyi 130-110-916
Micro BCA Protein Assay Kit Thermofisher 23235
M-PER Mammalian Extraction Buffer Thermofisher 78503
MS Columns Miltenyi 130-042-201 Referred as small columns in the protocol. 
MultiMACS Cell24 Separator Plus Miltenyi 130-098-637
PBSS, pH 7.4  Thermofisher 10010023
qScript XLT cDNA SuperMix Quanta biosciences 733-1177 The kit was used to syntesize cDNA.
ReliaPrep RNA Miniprep Systems Promega Z6011 The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA.
Vacutainer safety-lok 21 G Becton Dickinson 367282

References

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Cite This Article
Kyriakidou, E., Cutugno, G., Allard, C., Nadjar, A. Isolation of Hypothalamic Microglia from Freshly Perfused Adult Mouse Brain by Magnetic-Activated Cell Sorting . J. Vis. Exp. (211), e66769, doi:10.3791/66769 (2024).

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