Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente

La microglía corresponde al 5-20% del total de células neurales y son las únicas células gliales que se originan a partir de progenitores eritromieloides en el saco vitelino y comienzan a colonizar el cerebro en desarrollo alrededor del día embrionario E9.5 ^1,2. Son células longevas con la capacidad de auto-renovarse lentamente, independientemente de las células derivadas de la médula ósea³. Como algunas de las células más dinámicas, son capaces de adquirir diversos fenotipos en respuesta a señales contextuales y ambientales ^2,4. Entre las señales capaces de modular su actividad, el daño del sistema nervioso central (SNC), la actividad neuronal, así como los nutrientes, son los más potentes. Cada vez son más las investigaciones que demuestran el papel fundamental de la microglía en las lesiones, las enfermedades neurodegenerativas y la obesidad ^2,5,6. Sin embargo, el papel preciso de la microglía tanto en los procesos fisiológicos como en la fisiopatología requiere más estudio. Por lo tanto, su caracterización transcripcional, metabólica y funcional en diferentes condiciones es de gran importancia y requiere su aislamiento, ya que los estudios in situ son apropiados para la localización de ADN, ARN y proteínas y comparaciones cualitativas, así como para la caracterización morfológica de la microglía.

Existen diversas técnicas descritas para el aislamiento de microglía, entre las que se encuentran el método de gradiente de Percoll⁷, la clasificación celular por citometría de flujo (FACS)⁸ y la clasificación por células activadas magnéticamente (MACS). La selección del método apropiado depende de los objetivos del estudio y del nivel de pureza requerido para las aplicaciones posteriores. El aislamiento de la microglía pura del cerebro del ratón adulto, especialmente de pequeñas estructuras cerebrales como el hipotálamo, es un desafío debido al número limitado de células microgliales. La disociación suave y automatizada del hipotálamo mediante la tecnología Miltenyi permite la purificación de un rendimiento de microglía relativamente alto en poco tiempo con la capacidad de procesar hasta ocho muestras al mismo tiempo con un suave disociador Octo de MACS.

A la homogeneización de los tejidos le sigue la purificación de la microglía mediante la tecnología basada en columna MACS y las perlas supermagnéticas de tamaño nanométrico CD11b⁺. Por lo tanto, todas las muestras se procesan exactamente de la misma manera, produciendo células CD11b⁺ intactas. Cabe destacar que CD11b no está presente exclusivamente en la microglía, sino que también se expresa en otras células de linaje mieloide, incluidos los macrófagos y los monocitos⁹. Para limitar esto, la perfusión cerebral con solución salina helada antes de la extracción del hipotálamo (ver paso 2.6 del protocolo) asegura la eliminación de la mayoría de las células mieloides, dejando solo una fracción potencialmente pequeña de macrófagos residentes o adheridos a los vasos sanguíneos. Los macrófagos y monocitos residentes de un SNC en estado estacionario saludable constituyen un porcentaje menor del total de células inmunitarias cerebrales (~10% y <2% respectivamente)^10,11. Por lo tanto, cuando las células cerebrales se clasifican con perlas CD11b⁺, tanto la microglía como los macrófagos se pueden aislar, aunque la gran mayoría son microglía.

El rendimiento final de la microglía y el mantenimiento de su viabilidad nos permiten realizar ensayos ex vivo, así como in vitro, con la ventaja de analizar regiones cerebrales específicas de interés. La evidencia más reciente ha demostrado que la población de microglía es altamente heterogénea, representando la expresión génica específica de la región y las características morfológicas y funcionales ^2,12,13. Por lo tanto, el protocolo actual tiene como objetivo aislar y analizar la microglía adulta de una manera específica para cada región. De hecho, podemos caracterizar los perfiles genéticos, transcripcionales y traslacionales de la microglía hipotalámica adulta utilizando métodos como la RT-qPCR y la secuenciación de ARN, así como realizar análisis funcionales in vitro.