磁気活性化細胞選別による灌流したばかりの成体マウス脳からの視床下部ミクログリアの単離

ミクログリアは全神経細胞の5〜20%に相当し、卵黄嚢の赤骨髄前駆細胞に由来し、胚の日E9.5 ^1,2頃に発達中の脳にコロニーを形成し始める唯一のグリア細胞です。それらは、骨髄由来の細胞³とは無関係に、ゆっくりと自己再生を経る能力を持つ長寿命の細胞です。最も高度に動的な細胞の一部として、それらは文脈的および環境的な手がかりに応答して多様な表現型を獲得することができます^2,4。その活動を調節できるシグナルの中で、中枢神経系(CNS)の損傷、ニューロンの活動、および栄養素が最も強力です。ますます多くの研究が、怪我、神経変性疾患、および肥満におけるミクログリアの重要な役割を示しています^2,5,6。それにもかかわらず、生理学的プロセスと病態生理学の両方におけるミクログリアの正確な役割については、さらなる研究が必要です。したがって、DNA、RNA、タンパク質の局在化、定性的比較、およびミクログリアの形態学的特性評価にはin situ研究が適切であるため、さまざまな条件下でのそれらの転写、代謝、および機能の特性評価は非常に重要であり、それらの分離が必要です。

ミクログリアの単離には、Percoll勾配法⁷、フローサイトメトリー細胞選別法(FACS)⁸、磁気活性化細胞選別法(MACS)など、さまざまな手法が記載されています。適切な分析法の選択は、研究の目的と、ダウンストリームアプリケーションに必要な純度のレベルによって異なります。成体マウスの脳、特に視床下部のような小さな脳構造から純粋なミクログリアを単離することは、ミクログリア細胞の数が限られているため困難です。Miltenyi技術を使用した視床下部の自動穏やかな解離により、比較的高いミクログリアの収率を短時間で精製することができ、gentleMACS Octo Dissociatorを使用して最大8つのサンプルを同時に進めることができます。

組織の均質化に続いて、MACSカラムベースの技術と超磁性ナノサイズのCD11b⁺ビーズを使用したミクログリアの精製が行われます。したがって、すべてのサンプルはまったく同じ方法で処理され、無傷のCD11b⁺細胞が得られます。CD11bはミクログリアのみに存在するのではなく、マクロファージや単球を含む他の骨髄系譜細胞にも発現していることは注目に値する⁹。これを制限するために、視床下部抽出の前に氷冷生理食塩水による脳灌流(プロトコルステップ2.6を参照)は、ほとんどの骨髄細胞の排除を確実にし、常在マクロファージまたは血管に付着したマクロファージの潜在的に小さな部分のみを残します。健康な定常状態の中枢神経系の常在マクロファージおよび単球は、全脳免疫細胞のわずかな割合を構成する(それぞれ~10%および<2%)^10,11。したがって、脳細胞をCD11b⁺ビーズで選別すると、ミクログリアとマクロファージの両方を単離することができますが、大多数はミクログリアです。

ミクログリアの最終収量とその生存率の維持により、特定の脳領域を解析できる利点を活かして、ex vivoおよびin vitroアッセイを行うことができます。最新の証拠は、ミクログリア集団が非常に不均一であり、領域特異的な遺伝子発現と形態学的特性および機能を表している^{ことを示しています2,12,13}。したがって、現在のプロトコルは、地域特異的な方法で成虫のミクログリアを分離および分析することを目的としています。実際、成体の視床下部ミクログリアの遺伝的、転写的、翻訳的プロファイルを、RT-qPCRやRNAシーケンシングなどの方法を用いて、またin vitro機能解析を行うことで特徴づけることができます。