Выделение микроглии гипоталамуса из свежеперфузированного мозга взрослой мыши методом магнитно-активируемой сортировки клеток

Микроглия соответствует 5-20% от общего числа нервных клеток и является единственными глиальными клетками, которые происходят из эритромиелоидных предшественников в желточном мешке и начинают колонизировать развивающийся мозг примерно на эмбриональный день E9.5 ^1,2. Это долгоживущие клетки, обладающие способностью к медленному самообновлению, независимо от клеток, полученных из костного мозга³. Являясь одними из наиболее высокодинамичных клеток, они способны приобретать различные фенотипы в ответ на контекстуальные и экологические сигналы ^2,4. Среди сигналов, способных модулировать их активность, наиболее сильными являются повреждение центральной нервной системы (ЦНС), активность нейронов, а также питательные вещества. Растущее количество исследований демонстрирует ключевую роль микроглии в развитии травм, нейродегенеративных заболеваний и ожирения ^2,5,6. Тем не менее, точная роль микроглии как в физиологических процессах, так и в патофизиологии требует дальнейшего изучения. Поэтому их транскрипционная, метаболическая и функциональная характеристика в различных условиях имеет большое значение и требует их выделения, так как исследования in situ пригодны для локализации и качественного сравнения ДНК, РНК и белков, а также морфологической характеристики микроглии.

Существуют различные методы выделения микроглии, среди которых градиентный метод Перколля⁷, сортировка клеток с помощью проточной цитометрии (FACS)⁸ и сортировка магнитно-активированных клеток (MACS). Выбор подходящего метода зависит от целей исследования и требуемого уровня чистоты для последующих применений. Выделение чистой микроглии из мозга взрослой мыши, особенно из небольших структур мозга, таких как гипоталамус, является сложной задачей из-за ограниченного количества микроглиальных клеток. Автоматизированная щадящая диссоциация гипоталамуса с использованием технологии Miltenyi позволяет очищать относительно высокий выход микроглии за короткое время с возможностью одновременной обработки до восьми образцов с помощью gentleMACS Octo Dissociator.

Гомогенизация тканей сопровождается очисткой микроглии с помощью колоночной технологии MACS и сверхмагнитных наноразмерных гранул CD11b⁺. Таким образом, все образцы обрабатываются точно таким же образом, в результате чего получаются неповрежденные клетки CD11b⁺. Следует отметить, что CD11b присутствует не только в микроглии, но также экспрессируется на других клетках миелоидной линии, включая макрофаги и^{моноциты9}. Чтобы ограничить это, перфузия мозга ледяным физиологическим раствором перед экстракцией гипоталамуса (см. протокол шаг 2.6) обеспечивает элиминацию большинства миелоидных клеток, оставляя только потенциально небольшую часть резидентных макрофагов или тех, которые прилипают к кровеносным сосудам. Резидентные макрофаги и моноциты здоровой равновесной ЦНС составляют незначительный процент от общего числа иммунных клеток головного мозга (~10% и <2% соответственно)^10,11. Таким образом, когда клетки мозга сортируются с помощью гранул CD11b⁺, можно выделить как микроглию, так и макрофаги, хотя подавляющее большинство из них являются микроглией.

Конечный выход микроглии и поддержание ее жизнеспособности позволяют проводить анализы ex vivo, а также in vitro, с преимуществом анализа конкретных областей мозга, представляющих интерес. Последние данные показали, что популяция микроглии очень неоднородна, представляя специфическую для региона экспрессию генов и морфологические характеристики и функцию ^2,12,13. Таким образом, текущий протокол направлен на изоляцию и анализ микроглии взрослого человека в зависимости от региона. Действительно, мы можем охарактеризовать генетические, транскрипционные и трансляционные профили микроглии гипоталамуса у взрослых с помощью таких методов, как ОТ-кПЦР и секвенирование РНК, а также выполнить функциональный анализ in vitro.