Hipotalamik Mikroglia'nın Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Ayıklama ile Yeni Perfüze Edilmiş Yetişkin Fare Beyninden İzolasyonu
Summary
Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sınıflandırması (MACS) kullanarak fare hipotalamusundan (veya eşdeğer küçük beyin yapılarından) mikroglial hücreleri nispeten kısa sürede izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. MACS ile sıralanan hipotalamik mikroglia, ex vivo analiz için kullanılabilir ve in vitro testler yapmak üzere kaplanabilir.
Abstract
Beynin yerleşik makrofajları olan mikroglia, beyin homeostazını korumak için gereklidir. Gelişim sırasında nöronal devreleri şekillendirirler, çevrelerini enkaz veya ölü hücreler için incelerler ve diğer birçok işlevin yanı sıra beyindeki enfeksiyon ve yaralanmalara yanıt verirler. Bununla birlikte, nörogelişim ve sinaptik plastisite ve patofizyolojideki önemli rolleri tam olarak tanımlanmamıştır ve bu da daha fazla araştırmaya duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Mikroglia’nın bu süreçlerdeki rolünü daha kapsamlı bir şekilde anlamak için, mikrogliaları izole etmemiz ve bunları genetik, metabolik ve fonksiyonel olarak karakterize etmemiz gerekir. Bununla birlikte, mikroglia’nın yetişkin farelerden, özellikle küçük beyin yapılarından izolasyonu, toplam beyin hücrelerinin küçük bir yüzdesini temsil ettikleri ve izole edilmiş mikroglia’nın verimi genellikle çok düşük olduğu için zordur. Burada, CD11b + mikro boncuklar kullanılarak mikroglia’nın manyetik izolasyonu, mikroglial hücreleri yeni perfüze edilmiş bir yetişkin fare beyninin hipotalamusundan ayırmamıza izin verir. Mevcut yöntem, hücre canlılığını korurken kısa sürede nispeten yüksek saflık ve verim elde etmemizi sağlar.
Introduction
Mikroglia, toplam nöral hücrelerin %5-20’sine karşılık gelir ve yolk kesesi içindeki eritromiyeloid progenitörlerden köken alan ve gelişmekte olan beyni embriyonik gün E9.5 1,2 civarında kolonize etmeye başlayan tek glial hücrelerdir. Kemik iliği kaynaklı hücrelerden bağımsız olarak yavaş yavaş kendini yenileme yeteneğine sahip uzun ömürlü hücrelerdir3. En yüksek dinamik hücrelerden bazıları olarak, bağlamsal ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak çeşitli fenotipler elde edebilirler 2,4. Aktivitelerini modüle edebilen sinyaller arasında, merkezi sinir sistemi (CNS) hasarı, nöronal aktivite ve besinler en güçlü olanıdır. Artan bir araştırma grubu, mikroglia’nın yaralanma, nörodejeneratif hastalıklar ve obezitede önemli rolünü göstermiştir 2,5,6. Bununla birlikte, mikroglia’nın hem fizyolojik süreçlerde hem de patofizyolojideki kesin rolü daha fazla çalışma gerektirir. Bu nedenle, farklı koşullar altında transkripsiyonel, metabolik ve fonksiyonel karakterizasyonları büyük önem taşır ve izolasyonlarını gerektirir, çünkü in situ çalışmalar DNA, RNA ve protein lokalizasyonu ve kalitatif karşılaştırmaların yanı sıra mikroglia’nın morfolojik karakterizasyonu için uygundur.
Mikroglia izolasyonu için tanımlanmış çeşitli teknikler vardır, bunlar arasında Percoll gradyan yöntemi7, akış-sitometri hücre sıralaması (FACS)8 ve manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması (MACS) vardır. Uygun yöntemin seçimi, çalışmanın amaçlarına ve sonraki uygulamalar için gereken saflık seviyesine bağlıdır. Saf mikroglia’nın yetişkin fare beyninden, özellikle hipotalamus gibi küçük beyin yapılarından izolasyonu, sınırlı sayıda mikroglial hücre nedeniyle zordur. Miltenyi teknolojisi kullanılarak hipotalamusun otomatik olarak nazikçe ayrıştırılması, nazikMACS Octo Dissociator ile aynı anda sekiz numuneye kadar ilerleyebilme yeteneği ile kısa sürede nispeten yüksek bir mikroglia veriminin saflaştırılmasına olanak tanır.
Doku homojenizasyonunu, MACS kolon tabanlı teknoloji ve süper manyetik nano boyutlu CD11b+ boncuklar kullanılarak mikroglia saflaştırması takip eder. Bu nedenle, tüm numuneler tam olarak aynı şekilde işlenir ve bozulmamış CD11b+ hücreleri elde edilir. CD11b’nin sadece mikroglia’da bulunmadığı, aynı zamanda makrofajlar ve monositler9 dahil olmak üzere diğer miyeloid soy hücrelerinde de eksprese edildiği dikkat çekicidir. Bunu sınırlamak için, hipotalamus ekstraksiyonundan önce buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile beyin perfüzyonu (protokol adımı 2.6’ya bakınız), çoğu miyeloid hücrenin ortadan kaldırılmasını sağlar ve yerleşik makrofajların veya kan damarlarına yapışmış olanların potansiyel olarak küçük bir kısmını bırakır. Sağlıklı ve kararlı bir durum CNS’nin yerleşik makrofajları ve monositleri, toplam beyin bağışıklık hücrelerinin küçük bir yüzdesini oluşturur (sırasıyla ~%10 ve %<2)10,11. Bu nedenle, beyin hücreleri CD11b + boncukları ile sıralandığında, hem mikroglia hem de makrofajlar izole edilebilir, ancak büyük çoğunluğu mikrogliadır.
Mikroglia’nın son verimi ve canlılıklarının korunması, ilgilenilen belirli beyin bölgelerini analiz etme avantajı ile in vitro testlerin yanı sıra ex vivo olarak da gerçekleştirmemize izin verir. En son kanıtlar, mikroglia popülasyonunun oldukça heterojen olduğunu, bölgeye özgü gen ekspresyonunu ve morfolojik özellikleri ve işlevi temsil ettiğini göstermiştir 2,12,13. Bu nedenle, mevcut protokol yetişkin mikroglialarını bölgeye özgü bir şekilde izole etmeyi ve analiz etmeyi amaçlamaktadır. Gerçekten de, yetişkin hipotalamik mikroglia’nın genetik, transkripsiyonel ve translasyonel profillerini RT-qPCR ve RNA dizileme gibi yöntemler kullanarak ve ayrıca in vitro fonksiyonel analiz yaparak karakterize edebiliriz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, Manyetik Aktive Hücre Sıralama ile yeni perfüze edilmiş yetişkin fare beyninden hipotalamik mikroglia izolasyonunu sunmaktadır. Yukarıda sunulan sonuçlar, izole edilmiş hücrelerin saflığını ve canlılığını ve ayrıca bu yöntemin, örneğin fagositik aktivite ve ROS üretim ölçümü yoluyla mikroglia’yı ex vivo işlevsel olarak karakterize etmek için etkinliğini doğrulamaktadır. Belirli bir hücre popülasyonunun izolasyonu için klasik yöntemler mikroglial hücreler i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AN, Institut Universitaire de France (IUF), Bordeaux Üniversitesi, Fransız Beyin Araştırmaları Vakfı (FRC), GLN (Lipid-Beslenme Grubu) ve Ulusal Araştırma Ajansı (ANR, PRC 2023-MicroNRJ) tarafından desteklenmektedir. CA, Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962) tarafından desteklendi. Bu proje, MSCA Doktora Ağları 2021, No. 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY) kapsamında Avrupa Birliği’nin Ufuk Avrupa Araştırma ve İnovasyon Programından fon almıştır.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
References
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584 (2021).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Lee, J. -. K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
- Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
- Lee, E., Eo, J. -. C., Lee, C., Yu, J. -. W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395.e6 (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
- Tan, Y. -. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- . Available from: https://pamgene.com/wp-content/uploads/2022/03/1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells-V4.2-2022-03.pdf (2022)
- Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48 (2017).
- Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743 (2020).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790 (2019).
- Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
- DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152 (2019).
