Isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau d’une souris adulte fraîchement perfusée par tri cellulaire activé par magnétisme
Summary
Nous décrivons un protocole permettant d’isoler les cellules microgliales de l’hypothalamus de souris (ou de petites structures cérébrales équivalentes) en utilisant le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), dans un délai relativement court. La microglie hypothalamique triée par MACS peut être utilisée pour l’analyse ex vivo et peut être utilisée pour effectuer des essais in vitro .
Abstract
Les microglies, en tant que macrophages résidents du cerveau, sont essentielles au maintien de l’homéostasie du cerveau. Ils façonnent les circuits neuronaux au cours du développement, surveillent leur environnement à la recherche de débris ou de cellules mortes, et réagissent aux infections et aux lésions cérébrales, parmi de nombreuses autres fonctions. Cependant, leur rôle important dans le neurodéveloppement, la plasticité synaptique et la physiopathologie n’a pas été entièrement défini, ce qui souligne la nécessité d’études plus approfondies. Pour obtenir une compréhension plus complète du rôle de la microglie dans ces processus, nous devons isoler la microglie et la caractériser génétiquement, métaboliquement et fonctionnellement. Cependant, l’isolement des microglies chez les souris adultes, en particulier dans les petites structures cérébrales, est difficile car elles représentent un petit pourcentage de l’ensemble des cellules cérébrales et le rendement des microglies isolées est souvent trop faible. Ici, l’isolement magnétique de la microglie à l’aide de microbilles CD11b+ nous permet de trier les cellules microgliales de l’hypothalamus d’un cerveau de souris adulte fraîchement perfusé. La méthode actuelle nous permet d’obtenir une pureté et un rendement relativement élevés dans un court laps de temps tout en maintenant la viabilité cellulaire.
Introduction
Les microglies correspondent à 5 à 20% des cellules neurales totales et sont les seules cellules gliales qui proviennent de progéniteurs érythromyéloïdes dans le sac vitellin et commencent à coloniser le cerveau en développement vers le jour embryonnaire E9.5 1,2. Ce sont des cellules à longue durée de vie avec la capacité de s’auto-renouveler lentement, indépendamment des cellules dérivées de la moelle osseuse3. En tant que cellules parmi les plus dynamiques, elles sont capables d’acquérir divers phénotypes en réponse à des signaux contextuels et environnementaux 2,4. Parmi les signaux capables de moduler leur activité, les lésions du système nerveux central (SNC), l’activité neuronale, ainsi que les nutriments, sont les plus puissants. De plus en plus de recherches ont démontré le rôle central de la microglie dans les blessures, les maladies neurodégénératives et l’obésité2,5,6. Néanmoins, le rôle précis de la microglie dans les processus physiologiques et la physiopathologie nécessite des études plus approfondies. Par conséquent, leur caractérisation transcriptionnelle, métabolique et fonctionnelle dans différentes conditions est d’une grande importance et nécessite leur isolement, car les études in situ sont appropriées pour la localisation de l’ADN, de l’ARN et des protéines et les comparaisons qualitatives, ainsi que pour la caractérisation morphologique de la microglie.
Il existe diverses techniques décrites pour l’isolement de la microglie, parmi lesquelles la méthode du gradient de Percoll7, le tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS)8 et le tri cellulaire activé magnétiquement (MACS). Le choix de la méthode appropriée dépend des objectifs de l’étude et du niveau de pureté requis pour les applications en aval. L’isolement de la microglie pure du cerveau de la souris adulte, en particulier des petites structures cérébrales comme l’hypothalamus, est difficile en raison du nombre limité de cellules microgliales. La dissociation douce automatisée de l’hypothalamus à l’aide de la technologie Miltenyi permet de purifier un rendement microglial relativement élevé en peu de temps, avec la possibilité de procéder jusqu’à huit échantillons en même temps avec un Octo Dissociator gentleMACS.
L’homogénéisation des tissus est suivie d’une purification de la microglie à l’aide de la technologie MACS basée sur la colonne et des billes supermagnétiques de taille nanométrique CD11b+. Par conséquent, tous les échantillons sont traités exactement de la même manière, ce qui permet d’obtenir des cellules CD11b+ intactes. Il convient de noter que CD11b n’est pas exclusivement présent dans la microglie, mais qu’il est également exprimé sur d’autres cellules de la lignée myéloïde, notamment les macrophages et les monocytes9. Pour limiter cela, la perfusion cérébrale avec une solution saline glacée avant l’extraction de l’hypothalamus (voir l’étape 2.6 du protocole) assure l’élimination de la plupart des cellules myéloïdes, ne laissant qu’une fraction potentiellement faible des macrophages résidents ou de ceux qui adhèrent aux vaisseaux sanguins. Les macrophages et les monocytes résidents d’un SNC sain à l’état d’équilibre constituent un pourcentage mineur de l’ensemble des cellules immunitaires cérébrales (~10% et <2% respectivement)10,11. Par conséquent, lorsque les cellules cérébrales sont triées avec des billes CD11b+, les microglies et les macrophages peuvent être isolés, bien que la grande majorité soient des microglies.
Le rendement final des microglies et le maintien de leur viabilité nous ont permis d’effectuer des essais ex vivo, ainsi que des essais in vitro, avec l’avantage d’analyser des régions cérébrales spécifiques d’intérêt. Les dernières preuves ont montré que la population de microglies est très hétérogène, représentant l’expression génique spécifique à une région et les caractéristiques morphologiques et la fonction 2,12,13. Par conséquent, le protocole actuel vise à isoler et à analyser la microglie adulte d’une manière spécifique à la région. En effet, nous pouvons caractériser les profils génétiques, transcriptionnels et translationnels de la microglie hypothalamique adulte en utilisant des méthodes telles que la RT-qPCR et le séquençage de l’ARN, ainsi qu’en effectuant des analyses fonctionnelles in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel présente l’isolement de la microglie hypothalamique à partir du cerveau de souris adulte fraîchement perfusé par tri cellulaire activé magnétiquement. Les résultats présentés ci-dessus confirment la pureté et la viabilité des cellules isolées, ainsi que l’efficacité de cette méthode pour caractériser fonctionnellement la microglie ex vivo, par exemple par l’activité phagocytaire et la quantification de la production de ROS. Les méthodes classiques d’isolement d’une …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AN est soutenu par l’Institut Universitaire de France (IUF), l’Université de Bordeaux, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC), le GLN (Groupe Lipide-Nutrition), et l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, PRC 2023-MicroNRJ). CA a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-ARF201809006962). Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon Europe de l’Union européenne dans le cadre des réseaux doctoraux MSCA 2021, n° 101072759 (FuElThEbRaiNIn healtThYaging and age-related diseases, ETERNITY.
Materials
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 130-107-677 | The kit contains buffer Z, buffer Y, enzymes A and P, Debris Removal Solution, buffer A (to dissolve enzyme A). |
| Albumin Bovine FrV BSA | EuroMedex | 04-100-812-C | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, human and mouse – small size | Miltenyi | 130-093-636 | |
| CellROX Green Flow Cytometry Assay Kit | Invitrogen | C10492 | |
| Centrifuge Tube, Snap-Pop Lid 15 mL | CellTreat | 978449 | |
| DPBS, calcium, magnesium, glucose, pyruvate | Gibco | 14287-072 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi | 130-096-427 | |
| Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher | 78420 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free (100x) | Thermofisher | 78437 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14065056 | |
| Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | This reagent was used to perform PCR. |
| MACS SmartStrainers (70 µm) | Miltenyi | 130-110-916 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Thermofisher | 23235 | |
| M-PER Mammalian Extraction Buffer | Thermofisher | 78503 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | Referred as small columns in the protocol. |
| MultiMACS Cell24 Separator Plus | Miltenyi | 130-098-637 | |
| PBSS, pH 7.4 | Thermofisher | 10010023 | |
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quanta biosciences | 733-1177 | The kit was used to syntesize cDNA. |
| ReliaPrep RNA Miniprep Systems | Promega | Z6011 | The kit contains 1-Thioglycerol and BL buffer (referred as lysis buffer in the protocol) and it was used to isolate total RNA. |
| Vacutainer safety-lok 21 G | Becton Dickinson | 367282 |
References
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Alexaki, V. I. The impact of obesity on microglial function: immune, metabolic and endocrine perspectives. Cells. 10 (7), 1584 (2021).
- Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: mechanism and potential therapeutic targets. Sig Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
- Lee, J. -. K., Tansey, M. G. Microglia isolation from adult mouse brain. Microglia: Methods Mol Biol. 1041, 17-23 (2013).
- Schwarz, J. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. (2015), (2015).
- Lee, E., Eo, J. -. C., Lee, C., Yu, J. -. W. Distinct features of brain-resident macrophages: microglia and non-parenchymal brain macrophages. Mol Cells. 44 (5), 281-291 (2021).
- Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain’s immune compartment. Nat Neurosci. 20 (9), 1300-1309 (2017).
- Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395.e6 (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region−dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504-516 (2016).
- Tan, Y. -. L., Yuan, Y., Tian, L. Microglial regional heterogeneity and its role in the brain. Mol Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- . Available from: https://pamgene.com/wp-content/uploads/2022/03/1160-Preparation-Lysates-of-Cell-Lines-or-Purified-Cells-V4.2-2022-03.pdf (2022)
- Fonseca, M. I., et al. Cell-specific deletion of C1qa identifies microglia as the dominant source of C1q in mouse brain. J Neuroinflamm. 14 (1), 48 (2017).
- Simpson, D. S. A., Oliver, P. L. ROS generation in microglia: understanding oxidative stress and inflammation in neurodegenerative disease. Antioxidants. 9 (8), 743 (2020).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: homeostasis and disease. Front Immunol. 10, 790 (2019).
- Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nat Neurosci. 25 (3), 306-316 (2022).
- DePaula-Silva, A. B., et al. Differential transcriptional profiles identify microglial- and macrophage-specific gene markers expressed during virus-induced neuroinflammation. J Neuroinflammation. 16 (1), 152 (2019).
