조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)
Summary
여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
단일 세포 염기서열 분석은 조혈 장기의 기질에서 이질적인 세포 집단을 매핑할 수 있게 해주었습니다. 이러한 방법론은 정상 상태에서 이전에 해결되지 않은 이질성뿐만 아니라 외적 스트레스 또는 노화 중에 유발된 세포 유형 표현의 변화를 연구할 수 있는 렌즈를 제공합니다. 여기에서는 쥐와 인간의 흉선, 쥐 뼈 및 골수에서 고품질 기질 세포 집단을 분리하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜을 통해 분리된 세포는 고품질 단일 세포 멀티오믹스 데이터 세트를 생성하는 데 적합합니다. 여기에서는 시료 분해의 영향, 조혈 계통 고갈, FACS 분석/분류 및 이러한 요인이 단일 세포 염기서열분석과의 호환성에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 성공적이고 비효율적인 해리를 나타내는 FACS 프로파일과 염기서열분석 후 분석에서 다운스트림 기질 세포 수율의 예를 통해 사용자가 인식할 수 있는 포인터가 제공됩니다. 기질 세포의 특정 요구 사항을 고려하는 것은 해당 분야의 지식을 발전시킬 수 있는 고품질의 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다.
Introduction
건강한 성인의 경우, 골수와 흉선에서 혈액 세포의 새로운 생성이 발생합니다. 이 부위의 기질 세포는 조혈 유지에 필수적이지만 기질은 조직 1,2,3,4의 1% 미만을 구성합니다. 따라서 기질을 지지하는 조혈의 순수 분리물을 얻는 것은 특히 고품질 샘플을 얻기 위해 편리한 처리가 필요한 단세포 다생물체학의 경우 상당한 도전이 됩니다. 다양한 분해 칵테일의 구성 요소는 멀티오믹스 분석의 특정 단계를 방해할 수 있습니다 5,6. 여기에 제시된 프로토콜은 골수 및 흉선 조직에서 다양한 기질 세포를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다.
골수와 흉선의 기질 구성 성분의 교란은 혈액 세포 발달에 심각한 혼란을 초래하고 악성 종양을 초래할 수 있습니다 7,8,9. 세포독성 조건화 및 골수 이식 후 기질을 지지하는 조혈이 손상되어 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 지탱하는 사이토카인 및 성장 인자의 분비가 감소합니다2,10,11. 또한, 노화는 골수와 흉선 기질 세포에 영향을 미치며, 이는 노화된 조혈 표현형에 기여할 수 있습니다. 흉선(thymus)은 광범위한 노화 관련 침범을 겪는 첫 번째 장기입니다. 지방 및 섬유화 조직은 사춘기가 시작되자마자 T 세포 지지 기질을 대체하기 시작한다12,13. 골수에서는 지방세포 함량이 나이가 들면서 증가하고 혈관 및 내추 틈새가 크게 리모델링됩니다 14,15,16.
여러 스트레스 상태와 인간 및 쥐 조직 모두의 흉선의 경우 조혈 지지 기질에 대한 연구를 가능하게 하기 위해 이전에 발표된 소화 프로토콜 1,2,8,17,18을 최적화했습니다. 이러한 프로토콜은 효율적이고 재현 가능한 세포 분리를 보장하며 단일 세포 RNAsequencing(scRNAseq) 및 기타 유형의 멀티오믹스와 호환됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
조혈 장기의 기질 세포는 정상적인 혈액 생성에 중요하며, 조혈 기질 섭동은 조혈 유지 및 스트레스에 대한 반응에 심각한 장애를 초래할 수 있다 9,23,24. 조혈 기질 세포에 대한 통찰력은 혈액 질환을 이해하는 데 필수적입니다 7,9,10,24 및 이를 퇴치하기 위한 치료법을 <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
매사추세츠 종합병원(Massachusetts General Hospital)의 HSCI-CRM 유세포 분석 시설과 하버드 대학교(Harvard University)의 Bauer Core Facility로부터 전문적인 기술 지원을 받았습니다. T.K와 K.G는 스웨덴 연구 위원회(Swedish Research Council)가, C.M.은 독일 연구 재단(German Research Foundation)의 지원을 받았다. 단세포 RNA 염기서열 분석 데이터 분석에 도움을 주신 Sergey Isaev와 I-Hsiu Lee에게 감사드립니다.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
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