בידוד תאי סטרומה מאיברים המטופויטיים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקולים המאפשרים בידוד של תאי סטרומה מעצם מורין, מח עצם, בלוטת התימוס ורקמה תימית אנושית התואמת למולטיומיקה של תא יחיד.
Abstract
ריצוף חד-תאי איפשר מיפוי של אוכלוסיות תאים הטרוגניות בסטרומה של איברים המטופויטיים. מתודולוגיות אלה מספקות עדשה שדרכה ניתן לחקור הטרוגניות שלא נפתרה בעבר במצב יציב, כמו גם שינויים בייצוג סוג התא הנגרמים על ידי לחצים חיצוניים או במהלך ההזדקנות. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים הדרגתיים לבידוד אוכלוסיות תאי סטרומה באיכות גבוהה מבלוטת התימוס האנושית והמורין, כמו גם עצם מורין ומח עצם. תאים המבודדים באמצעות פרוטוקולים אלה מתאימים ליצירת מערכי נתונים מולטיומיים באיכות גבוהה של תא יחיד. ההשפעות של עיכול דגימות, דלדול שושלת המטופויטית, ניתוח/מיון FACS וכיצד גורמים אלה משפיעים על תאימות עם ריצוף תא בודד נדונים כאן. עם דוגמאות של פרופילי FACS המצביעים על דיסוציאציה מוצלחת ולא יעילה ותפוקות תאי סטרומה במורד הזרם בניתוח שלאחר ריצוף, ניתנים מצביעים מזוהים למשתמשים. התחשבות בדרישות הספציפיות של תאי סטרומה היא קריטית להשגת תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור שיכולות לקדם את הידע בתחום.
Introduction
אצל מבוגר בריא, ייצור דה נובו של תאי דם מתרחש במח העצם ובבלוטת התימוס. תאי סטרומה באתרים אלה חיוניים לתחזוקת המטופויזה, אך סטרומה מהווה פחות מ-1% מהרקמה 1,2,3,4. השגת מבודדים טהורים של המטופויזה התומכת בסטרומה מהווה אפוא אתגר משמעותי, במיוחד עבור מולטיומיקה של תא בודד הדורשת עיבוד מהיר כדי לקבל דגימות באיכות גבוהה. רכיבים של קוקטיילים שונים לעיכול עלולים להפריע לשלבים מסוימים בניתוח מולטיומיקס 5,6. הפרוטוקולים המוצגים כאן מפרטים את בידודם של מגוון רחב של תאי סטרומה ממח עצם ומרקמות תימיות.
הפרעות של מרכיבי סטרומה הן במח העצם והן בבלוטת התימוס גורמות להפרעה עמוקה בהתפתחות תאי הדם ויכולות לגרום לממאירויות 7,8,9. המטופויזה התומכת בסטרומה נפגעת בעקבות התניה ציטוטוקסית והשתלת מח עצם, וכתוצאה מכך מופחתת הפרשת ציטוקינים וגורמי גדילה המקיימים תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs)2,10,11. יתר על כן, הזדקנות משפיעה על מח העצם ותאי סטרומה של בלוטת התימוס, מה שככל הנראה תורם לפנוטיפים המטופויטיים מזדקנים. בלוטת התימוס היא האיבר הראשון שעבר אינבולוציה נרחבת הקשורה לגיל. רקמות שומן ופיברוטיקה מתחילות להחליף סטרומה תומכת תאי T כבר בתחילת ההתבגרות המינית12,13. במוח העצם, תכולת האדיפוציט עולה עם הגיל ונישות כלי הדם והאנדוסטל משופצות באופן משמעותי 14,15,16.
כדי לאפשר מחקר של סטרומה תומכת בהמטופויזיס במצבי עקה מרובים ובמקרה של בלוטת התימוס של רקמת האדם ושל רקמת מורין, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולי עיכול 1,2,8,17,18 שפורסמו בעבר. פרוטוקולים אלה מבטיחים בידוד יעיל וניתן לשחזור של תאים, והם תואמים לריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq) ולסוגים אחרים של מולטיומיקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי סטרומה באיברים המטופויטיים הם קריטיים לייצור דם תקין והפרעות סטרומה המטופויטיות עלולות לגרום לליקויים חמורים בתחזוקה ההמטופויטית ובתגובה ללחץ 9,23,24. תובנה של תאי סטרומה hematopoietic חיונית להבנת מחלות המטולוגיות 7,9,10,24 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמכנו בסיוע טכני מקצועי על ידי מתקן HSCI-CRM Flow Cytometry בבית החולים הכללי של מסצ’וסטס ומתקן Bauer Core באוניברסיטת הרווארד. T.K ו-K.G נתמכו על ידי מועצת המחקר השבדית ו-C.M. על ידי קרן המחקר הגרמנית. אנו מודים לסרגיי Isaev ול- I-Hsiu Lee על הסיוע בניתוח נתוני ריצוף RNA של תא יחיד.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
