Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici
Summary
Qui presentiamo protocolli che consentono l’isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.
Abstract
Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l’eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l’invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l’isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall’osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l’esaurimento del lignaggio ematopoietico, l’analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell’analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.
Introduction
Nell’adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell’emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell’1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un’elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con alcune fasi dell’analisi multiomica 5,6. I protocolli qui presentati descrivono in dettaglio l’isolamento di un’ampia varietà di cellule stromali dal midollo osseo e dai tessuti timici.
Le perturbazioni dei costituenti stromali sia nel midollo osseo che nel timo provocano una profonda interruzione dello sviluppo delle cellule del sangue e possono provocare tumori maligni 7,8,9. L’emopoiesi che supporta lo stroma viene danneggiata in seguito al condizionamento citotossico e al trapianto di midollo osseo, con conseguente riduzione della secrezione di citochine e fattori di crescita che sostengono le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC)2,10,11. Inoltre, l’invecchiamento colpisce le cellule stromali del midollo osseo e del timo, contribuendo probabilmente ai fenotipi ematopoietici invecchiati. Il timo è il primo organo a subire un’estesa involuzione associata all’età. Il grasso e il tessuto fibrotico iniziano a sostituire lo stroma di supporto delle cellule T già all’inizio della pubertà12,13. Nel midollo osseo, il contenuto di adipociti aumenta con l’età e le nicchie vascolari ed endostali sono significativamente rimodellate 14,15,16.
Per consentire lo studio dello stroma di supporto all’emopoiesi in più stati di stress e nel caso del timo sia del tessuto umano che di quello murino, abbiamo ottimizzato i protocolli di digestione precedentemente pubblicati 1,2,8,17,18. Questi protocolli garantiscono un isolamento efficiente e riproducibile delle cellule e sono compatibili con il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNAseq) e altri tipi di multiomica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress 9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di svi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo stati supportati con l’assistenza tecnica di esperti dalla struttura di citometria a flusso HSCI-CRM del Massachusetts General Hospital e dalla struttura Bauer Core dell’Università di Harvard. T.K e K.G sono stati sostenuti dal Consiglio svedese per la ricerca e C.M. dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Ringraziamo Sergey Isaev e I-Hsiu Lee per l’assistenza nell’analisi dei dati di sequenziamento dell’RNA a singola cellula.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
