Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques
Summary
Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.
Abstract
Le séquençage unicellulaire a permis de cartographier des populations cellulaires hétérogènes dans le stroma des organes hématopoïétiques. Ces méthodologies fournissent une lentille à travers laquelle étudier l’hétérogénéité jusqu’alors non résolue à l’état d’équilibre, ainsi que les changements dans la représentation du type cellulaire induits par des stress extrinsèques ou au cours du vieillissement. Ici, nous présentons des protocoles par étapes pour l’isolement de populations de cellules stromales de haute qualité à partir du thymus murin et humain, ainsi que de l’os et de la moelle osseuse murins. Les cellules isolées par ces protocoles conviennent à la génération d’ensembles de données multiomiques unicellulaires de haute qualité. Les impacts de la digestion des échantillons, de l’appauvrissement de la lignée hématopoïétique, de l’analyse/tri FACS et de la façon dont ces facteurs influencent la compatibilité avec le séquençage unicellulaire sont discutés ici. Avec des exemples de profils FACS indiquant une dissociation réussie et inefficace et des rendements de cellules stromales en aval dans l’analyse post-séquençage, des indications reconnaissables pour les utilisateurs sont fournies. La prise en compte des exigences spécifiques des cellules stromales est cruciale pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles qui peuvent faire progresser les connaissances dans le domaine.
Introduction
Chez l’adulte en bonne santé, la production de novo de cellules sanguines se produit dans la moelle osseuse et le thymus. Les cellules stromales à ces sites sont essentielles au maintien de l’hématopoïèse, mais le stroma constitue moins de 1% du tissu 1,2,3,4. L’obtention d’isolats purs d’hématopoïèse soutenant le stroma constitue donc un défi important, en particulier pour la multiomique unicellulaire qui nécessite un traitement rapide pour obtenir des échantillons de haute qualité. Les composants de différents cocktails de digestion peuvent interférer avec certaines étapes de l’analyse multiomique 5,6. Les protocoles présentés ici détaillent l’isolement d’une grande variété de cellules stromales à partir de la moelle osseuse et des tissus thymiques.
Les perturbations des constituants stromaux dans la moelle osseuse et le thymus entraînent une perturbation profonde du développement des cellules sanguines et peuvent entraîner des tumeurs malignes 7,8,9. L’hématopoïèse soutenant le stroma est endommagée à la suite d’un conditionnement cytotoxique et d’une greffe de moelle osseuse, ce qui entraîne une réduction de la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance qui soutiennent les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)2,10,11. De plus, le vieillissement affecte les cellules stromales de la moelle osseuse et du thymus, contribuant probablement aux phénotypes hématopoïétiques âgés. Le thymus est le premier organe à subir une involution importante associée à l’âge. La graisse et le tissu fibreux commencent à remplacer le stroma de soutien des lymphocytes T dès le début de la puberté12,13. Dans la moelle osseuse, la teneur en adipocytes augmente avec l’âge et les niches vasculaires et endostatives sont significativement remodelées 14,15,16.
Pour permettre l’étude du stroma de soutien à l’hématopoïèse dans plusieurs états de stress et dans le cas du thymus des tissus humains et murins, nous avons optimisé les protocoles de digestion précédemment publiés 1,2,8,17,18. Ces protocoles garantissent une isolation efficace et reproductible des cellules, et ils sont compatibles avec le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et d’autres types de multiomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules stromales dans les organes hématopoïétiques sont essentielles à la production normale de sang et les perturbations du stroma hématopoïétique peuvent entraîner de graves altérations de l’entretien hématopoïétique et de la réponse au stress 9,23,24. La connaissance des cellules stromales hématopoïétiques est essentielle pour comprendre les maladies hématologiques …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous avons bénéficié de l’assistance technique d’experts de l’installation de cytométrie en flux HSCI-CRM du Massachusetts General Hospital et de la plateforme Bauer de l’Université Harvard. T.K. et K.G. ont été soutenus par le Conseil suédois de la recherche et C.M. par la Fondation allemande pour la recherche. Nous remercions Sergey Isaev et I-Hsiu Lee pour leur aide dans l’analyse des données de séquençage de l’ARN unicellulaire.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
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