Alle Arbeiten mit menschlichem Gewebe wurden nach Genehmigung durch das Massachusetts General Hospital Internal Review Board (IRB) durchgeführt. Alle Eingriffe an den Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden C57Bl/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen und sowohl Männchen als auch Weibchen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). 1. Aufbereitung von murinem Thymusgewebe Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.Medium 199 (M199) mit 2 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) (siehe Materialtabelle). Muriner Dissoziationscocktail: 0,5 WU/mL Liberase TM und 6,3 U/mL DNase I in M199 + 2% FBS (siehe Materialtabelle). M199 mit 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA).HINWEIS: FBS-haltiges Medium kann auf BSA umgestellt werden, um die RNA-Qualität zu verbessern. Führen Sie die murine Thymusdissektion durchEuthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung (nach institutionell anerkannten Protokollen) und legen Sie sie auf den Rücken. Befeuchten Sie das Fell auf der Brust mit 70% Ethanol und öffnen Sie die Brusthöhle. Präparieren Sie den Thymus vorsichtig, indem Sie zuerst mit einer chirurgischen Schere einen Querschnitt direkt unterhalb des Brustkorbs vornehmen. Schneide die Rippen auf jeder Seite der Maus bis zum Schlüsselbein ein. Schneide dann das Zwerchfell ab, damit sich die Brustwand lösen kann. Hebe die Rippen mit einer Pinzette an, um die Brusthöhle freizulegen.Der Thymus ist ein weißes, bilobuläres Organ, das am oberen Ende der Höhle direkt über dem Herzen sitzt. Halten Sie den Thymus mit der Pinzette fest und schneiden Sie vorsichtig das Bindegewebe durch, das den Thymus an Ort und Stelle hält. Legen Sie das präparierte Thymusgewebe in die Vertiefung einer 6-Well-Platte mit M199 + 2% FBS auf Eis.HINWEIS: Bei der Arbeit mit gealterten oder strahlenkonditionierten Mäusen oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten kann der Thymus so klein sein, dass ein Präpariermikroskop erforderlich ist, um das Organ zuverlässig zu entfernen. Entfernen Sie mit einem Präpariermikroskop extrathymisches Gewebe mit einer stumpfen Pinzette und einer Mikrofederschere. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von murinem Thymusgewebe (30 min in Schritten von 10 min)Legen Sie den gereinigten Thymus in die Kappe eines 15-ml-Röhrchens und hacken Sie das Gewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere fein auf.HINWEIS: Das Zerkleinern des Gewebes in der Kappe des Röhrchens, das für die Verdauung verwendet werden soll, minimiert den Gewebeverlust durch den Transfer von einem Behälter in einen anderen. Dies ist sehr wichtig bei der Arbeit mit gealterten oder strahlenkonditionierten Mäusen oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten. Die geringe Thymusgröße in diesen Umgebungen erfordert es, den Materialverlust so weit wie möglich zu reduzieren. Geben Sie 2 ml murinen Dissoziationscocktail in das 15-ml-Röhrchen, setzen Sie die Kappe mit den Thymusstücken auf und drehen Sie sie 5 Mal um, um sicherzustellen, dass das Gewebe im Dissoziationscocktail resuspendiert wird. Um ein Auslaufen zu verhindern, wickeln Sie die Kappe des Schlauchs in Paraffinfolie ein. Legen Sie dann den Schlauch waagerecht in ein 37 °C warmes Wasserbad mit 250 U/min Schütteln. 10 Min. inkubieren.HINWEIS: Der Erfolg des Aufschlussprotokolls hängt davon ab, ob die Inkubation bei 37 °C und unter Rühren durchgeführt wird. Das beschriebene Protokoll wurde mit Hilfe eines Schüttelwasserbads optimiert. Wenn dies nicht verfügbar ist, können andere Ansätze funktionieren, die das Rühren in einer hitzigen Umgebung ermöglichen, aber es wird empfohlen, das Protokoll zuerst für diese Einstellungen zu optimieren. Legen Sie das 15-ml-Röhrchen in ein Gestell und lassen Sie die Gewebestücke absetzen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und geben Sie ihn über ein 70 μm Zellsieb in ein eiskaltes 50 ml Röhrchen. Wiederholen Sie die Schritte 2-4 zweimal für insgesamt 3 Verdauungsrunden. Das Gewebe sollte bis zum Ende der letzten Inkubation mehr oder weniger vollständig dissoziiert sein. Geben Sie 20 ml M199 + 2 % FBS in die gesammelte Zellsuspension. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C runterschleudern. Den Überstand entfernen und in einem geeigneten Volumen von M199 + 2 % FBS resuspendieren. Fahren Sie dann mit der Zellzählung fort.HINWEIS: Das Volumen von M199 + 2 % FBS, in dem resuspendiert werden soll, hängt vom Zustand des Thymus ab. Für 6-10 Wochen alte Mäuse empfehlen wir, das Gewebe in 3-4 ml M199 + 2% FBS zu resuspendieren. Für Experimente mit gealtertem oder strahlenkonditioniertem Gewebe oder mutierten Stämmen mit Thymusdefekten erfordert die kleine Thymusgröße jedoch geringere Volumina von 0,1 bis 1 ml. Zählen Sie die Zellen, indem Sie die Zellsuspension 1:2 in 0,4%iger (w/v) Trypanblau-Lösung verdünnen. Legen Sie die Zellen auf ein Hämozytometer und zählen Sie sie unter einem Hellfeldmikroskop. Zählen Sie ungefärbte Zellen, um die Anzahl der lebenden Zellen pro Milliliter zu bestimmen, und die Anzahl der blau gefärbten Zellen, um die Lebensfähigkeit der Probe zu beurteilen. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung des murinen ThymusstromasSchleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Resuspendieren Sie Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml in M199 + 2 % FBS, ergänzt mit 25 U/ml Protector RNase Inhibitor (siehe Materialtabelle). murinen Fc-Block (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 2 μg/ml zugeben und 10 min bei 4 °C inkubieren. Färben Sie die Zellen mit den folgenden Antikörpern: CD45-PE/Cy7 (4 μg/ml), Ter119-PE (4 μg/ml), CD31-BUV737 (2 μg/ml) und EpCam-BV711 (2 μg/ml) (siehe Materialtabelle) für 30 min bei 4 °C. Die Proben in M199 + 2% BSA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in M199 + 2 % BSA, die einen Viabilitätsfarbstoff wie DAPI (0,5 μg/ml) oder 7-AAD (1 μg/ml) enthalten (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Thymusstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19. 2. Aufbereitung von menschlichem Thymusgewebe Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.Medium 199 (M199) mit 2% (v/v) FBS. M199 mit 1,5 % (w/v) BSA. Dissoziationscocktail beim Humanen: 1 mg/ml Kollagenase IV und 2 mg/ml Dispase und 6,3 U/ml DNase I in M199 +1,5% BSA (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Der letzte Verdauungsschritt bei der Aufbereitung von menschlichem Thymusgewebe umfasst Trypsin. Es ist daher wichtig, dass alle Schritte bis zu diesem Zeitpunkt in BSA-haltigen Puffern durchgeführt werden, da FBS die Trypsinaktivität hemmt. Führen Sie die Isolierung von menschlichem Thymusgewebe durchDer menschliche Thymus (entnommen nach der zuvor veröffentlichten Methode19) wird in ein geeignetes Volumen von M199 + 1,5 % BSA gegeben und bis zum Beginn der Verarbeitung auf Eis gelagert. Wenn Sie mit menschlichem Thymusgewebe arbeiten, behandeln Sie es so, als ob es potenziell infektiös wäre, indem Sie die Arbeit in einer Gewebekulturhaube durchführen und die Standardvorsichtsmaßnahmen gemäß den CDC-Richtlinien20 anwenden. Geben Sie das Gewebe in eine 10 cm große Petrischale mit 10 mL eiskaltem M199 + 1,5% BSA. Reinigen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere vorsichtig extrathymisches Fett oder Gewebe, das bei der Entnahme des Organs beschädigt wurde. Schneiden Sie den Thymus mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette in 1 cm3 Würfel und drücken Sie mit dem Kolben einer 10-ml-Spritze vorsichtig auf die Stücke. Dadurch wird ein Teil der sich entwickelnden Thymozyten freigesetzt und so das Volumen des zu verdauenden Gewebes reduziert.HINWEIS: Bewahren Sie die freigesetzte hämatopoetische Fraktion auf, wenn eine anschließende Analyse der Entwicklungsstadien der Thymozyten erforderlich ist. Kombinieren Sie diese Fraktion jedoch nicht mit der Stromazellfraktion, die bei der enzymatischen Verdauung entsteht. Es wurde beobachtet, dass das Poolen der beiden Fraktionen das Risiko der Bildung von Verstopfungen in der Zellsuspension signifikant erhöht, was letztendlich die Ausbeute an Stromazellen verringert. Bei der schonenden Zerkleinerung des Gewebes gehen nur wenige Stromazellen verloren. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von menschlichem Thymusgewebe (90 min in Schritten von 30 min)Übertragen Sie ca. 5 mg der leicht zerkleinerten Thymusgewebestücke auf die Kappe eines konischen 50-ml-Röhrchens. Schneiden Sie dann das Gewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere fein ab. Pipettieren Sie 8 ml des humanen Dissoziationscocktails in das 50-ml-Röhrchen, setzen Sie die Kappe mit dem gehackten menschlichen Thymusgewebe auf und drehen Sie das Röhrchen dann vorsichtig 5 Mal um, um sicherzustellen, dass das gesamte Gewebe mit dem Enzymcocktail vermischt wird. Sichern Sie die Kappe der Tube mit Paraffinfolie, um ein Auslaufen zu verhindern. Inkubieren Sie das Röhrchen horizontal in einem Schüttelwasserbad (250 U/min) bei 37 °C für 30 Minuten. Legen Sie das 50-ml-Röhrchen in ein Gestell und lassen Sie die menschlichen Thymusgewebestücke absetzen, bevor Sie den Überstand entfernen und über ein 70-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen geben, das auf Eis gestellt wird. Die Schritte 2.3.2 bis 1.3.4 sind für insgesamt zwei Verdauungsrunden mit dem Dissoziationscocktail beim Menschen zu wiederholen. Nachdem die zweite Verdauungsrunde abgeschlossen ist, fügen Sie dem verbleibenden Gewebe weitere 8 ml des menschlichen Dissoziationscocktails hinzu. Pipettieren Sie dann ebenfalls 2 mL 0,25% Trypsin in das Dissoziationsröhrchen. Weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubieren und bei 250 U/min schütteln.HINWEIS: Es ist absolut notwendig, dass die Verdauungszeit für menschliches Gewebe mindestens 90 Minuten beträgt, da kürzere Inkubationszeiten zu drastisch reduzierten Stromazellerträgen führen. Sobald der letzte Inkubationsschritt abgeschlossen ist, werden die Zellsuspension und die verbleibenden Gewebefragmente mit dem in den vorherigen Schritten gesammelten Überstand gepoolt, indem Sie ein 70-μm-Zellsieb passieren. Geben Sie 3 mL FBS in die Probe, um die Trypsinreaktion zu unterbrechen, und legen Sie es auf Eis. Fahren Sie mit der Zählung der Zellen fort, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung des humanen ThymusstromasDie Zellsuspension des menschlichen Thymus wird heruntergeschleudert und in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/ml in M199 + 2 % FBS, ergänzt mit 25 U/ml, Protector RNase-Inhibitor, resuspendiert. Mit humanem Fc-Block (5 μg/ml) (siehe Materialtabelle) für 10 min bei 4 °C inkubieren. Färben Sie die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C mit CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/ml), Lineage-Cocktail-FITC (3,76 μg/ml), CD66b-FITC (20 μL/100 μL Probe), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL Probe), CD4-BV605 (5 μL/100 μL Probe), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/ml) und EpCam-BV421 (2,5 μg/ml) (siehe Materialtabelle). Die Proben in M199 + 1,5 % BSA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Zellen in M199 + 1,5 % BSA, die einen Viabilitätsfarbstoff wie DAPI (0,5 μg/ml) oder 7-AAD (1 μg/ml) enthalten. Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Thymusstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19. 3. Aufbereitung von murinem Knochen- und Knochenmarkgewebe HINWEIS: Knochen- und Knochenmarkfraktionen werden in zwei getrennten Verdauungsreaktionen hergestellt, um maximale Reinheit der Stromazellen und eine optimale Dissoziation des Gewebes zu erreichen. Die Proben können nach den Aufschlussschritten gepoolt werden, um als ein Stromakompartiment sortiert zu werden. Bereiten Sie die folgenden Puffer und Lösungen vor.M199 mit 2% (v/v) FBS. Muriner B&M-Dissoziationscocktail (Knochen und Knochenmark): Stemxym 2 mg/ml, Dispase 1 mg/ml und 10 U/mL DNase I (siehe Materialtabelle) in M199 +2% FBS.HINWEIS: Bereiten Sie die B&M-Dissoziationsmischung frisch zu und bewahren Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis auf. M199 mit 0,5 % (w/v) BSA. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,5 % (w/v) BSA. M199 mit 2% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA.HINWEIS: FBS-haltiges Medium kann auf BSA umgeschaltet werden, um die RNA-Qualität zu verbessern. Durchführung einer murinen KnochenmarktrennungEuthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Erstickung (nach institutionell anerkannten Protokollen). Mit 70% Ethanol besprühen, um das Fell zu befeuchten. Entfernen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen, das Schienbein, das Becken und den Oberarmknochen von jeder Seite und legen Sie sie in eine Vertiefung mit M199 + 2 % FBS auf Eis21,22. Entfernen Sie sämtliches Muskel-, Bänder- und Knorpelgewebe mit Gewebetüchern, um Schäden am Knochen zu minimieren und die Periostschicht zu erhalten. Legen Sie sie in eine neue Vertiefung mit M199 + 2% FBS auf Eis. Mit einem Skalpell die Wachstumsfugen der langen Knochen durchschneiden, um die Epiphyse zu entfernen und in eine 10 cm Schale mit M199 + 2% FBS auf Eis zu legen. Spülen Sie das Knochenmark aus den Knochen, bis es hellweiß ist. Verwenden Sie eine 28 g Nadel und eine 10 mL Spritze, die mit 10 mL M199 + 2% FBS gefüllt sind, um das Mark in ein 15 mL Röhrchen auf Eis zu spülen. Legen Sie den gespülten Knochen in die 10 cm Schale mit der Epiphyse.HINWEIS: Eine vollständige Spülung des Knochenmarks für eine vollständige Trennung des Gewebes führt zu einer besseren Probenvorbereitung. Durchführung einer enzymatischen Dissoziation von murinem Knochenmarkgewebe (insgesamt 30 min in Schritten von 10 min)Lassen Sie das 15-ml-Röhrchen aufrecht auf Eis stehen, bis das Mark auf den Boden des Röhrchens sinkt. Entfernen Sie die 10 mL M199 + 2% FBS langsam durch Pipettieren. Geben Sie 4 mL B&M Dissoziationscocktail in das 15 mL Röhrchen und legen Sie es für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad (kein Schütteln). Nach 5 Minuten drehen Sie den Schlauch dreimal um und legen Sie ihn wieder in das Wasserbad. Stellen Sie nach den ersten 10 Minuten sicher, dass sich das Pellet am Boden befindet, und sammeln Sie den Überstand, während Sie durch ein 70-μm-Zellsieb in ein eiskaltes 50-ml-Röhrchen filtrieren. Geben Sie 2 mL frischen B&M-Dissoziationscocktail zum restlichen BM-Pellet und legen Sie es wieder in das Wasserbad. Dissoziieren Sie alle verbleibenden Knochenmarkstücke durch kräftiges Pipettieren mit einer 1-ml-Pipette. Sammeln Sie die gesamte resultierende Zellsuspension im selben Röhrchen wie in den vorherigen Schritten. Geben Sie 20 mL M199 + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA in die gesammelte Zellsuspension.HINWEIS: In Schritt 3.3.5 enthält der Puffer, der nach der abschließend aufgeschlossenen Probe hinzugefügt wird, EDTA, um die Hemmung weiterer enzymatischer Aktivitäten zu unterstützen. Durchführung einer hämatopoetischen Zelldepletion von murinem Knochenmarkgewebe.Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie in 500 μl PBS + 0,5 % BSA mit Biotin-Antikörpern (5 mg/ml), die auf CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 und CD3 abzielen (siehe Materialtabelle). In ein Röhrchen mit rundem Boden und Kappe umfüllen. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Wirbeln Sie die Magnetkügelchen gründlich durch und geben Sie 25 μl Magnetkügelchen in das Röhrchen. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Legen Sie das Röhrchen für 2-3 min in den passenden Magneten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen.HINWEIS: Das Knochenmark kann nach diesem Schritt gepoolt oder getrennt von der Knochenfraktion aufbewahrt werden. Wenn die Depletion der Abstammungslinie erfolgreich ist, sollte die resultierende Zellsuspension frei von roten Blutkörperchen sein. Führen Sie eine enzymatische Dissoziation von murinem Knochengewebe durch.Brechen Sie die Knochen in der 10-cm-Schale mit dem flachen Kappenende eines 50-ml-Röhrchens in kleinere Stücke. Filtrieren Sie den Überstand durch ein 70-μm-Zellsieb, um Knochenfragmente im Inneren des Filters zu isolieren.HINWEIS: Alternativ kann ein Mörser und Stößel zur Knochenfragmentierung verwendet werden. Diese Option neigt jedoch dazu, mehr Ablagerungen zu erzeugen und die Lebensfähigkeit der Stromazellen zu verringern, wenn der Knochen zermahlen und nicht gebrochen wird. Die Stromazellen sind noch am und im Knochen befestigt, und der Überstand mit den hämatopoetischen Zellen ist zu verwerfen. Schneiden Sie mit einer Schere die Knochenfragmente in das Zellsieb. Dadurch wird die Oberfläche für eine effizientere enzymatische Dissoziation vergrößert. Waschen Sie den Knochen mit 5 mL M199 + 2% FBS. Geben Sie die Knochenfraktion in 5 mL murines B&M-Dissoziationsgemisch (siehe Materialtabelle) in ein neues 50-ml-Röhrchen. Um ein Auslaufen zu verhindern, wickeln Sie die Kappe des Schlauchs in Paraffinfolie ein. Legen Sie dann den Schlauch waagerecht in ein 37 °C warmes Wasserbad mit 120 U/min und schütteln Sie ihn 30 min lang. Nach dem Aufschluss werden 25 mL M199 + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA zugegeben und der Überstand mit den Stromazellen durch ein 70 μm Zellsieb in ein eiskaltes 50 ml Röhrchen filtriert.HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass die entstandenen Knochenfragmente durch die Verdauung sichtbar vermindert wurden. In Schritt 3.5.5 enthält der Puffer, der nach der abschließend aufgeschlossenen Probe zugegeben wird, EDTA, um die Hemmung weiterer enzymatischer Aktivität zu unterstützen. Durchführung einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von murinem Knochen und Knochenmarkstroma.Schleudern Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C herunter. In murinen Fc-Zellen resuspendieren: Bei einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA blockieren und 10 min bei 4 °C inkubieren. Färben Sie die Zellen (bis zu 10 Millionen Zellen/100 μl Gesamtfärbevolumen) mit den folgenden Antikörpern: CD45-PE/Cy7 (1 μg/ml), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/ml), CD31-BV421 (0,66 μg/ml), CD140a-APC (2 μg/ml), Sca1-AF700 (0,66 μg/ml), CD51-PE (2 μg/ml), CD105-PE/Dazzle (2 μg/ml) (siehe Materialtabelle). Lassen Sie Calcein-AM auf Raumtemperatur äquilibrieren und resuspendieren Sie es in 50 μl DMSO. Frisch zubereiten für jeden Gebrauch. Nach der Aufwirbelung bei Raumtemperatur aufbewahren. Das Calcein in PBS (0,1 mg/ml) vorverdünnen, bevor es der bereits im Antikörper-Färbecocktail resuspendierten Probe (20 μg/ml) zugesetzt wird, und 20-30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Die Proben in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA waschen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA. Fahren Sie mit der FACS-Isolierung von Knochen- und Knochenmarkstromazellen gemäß den festgelegten Protokollenfort 19.