Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu
Summary
Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.
Abstract
Tek hücre dizilemesi, hematopoietik organların stromasındaki heterojen hücre popülasyonlarının haritalanmasını sağlamıştır. Bu metodolojiler, kararlı durumda daha önce çözülmemiş heterojenliğin yanı sıra, dışsal stresler veya yaşlanma sırasında indüklenen hücre tipi temsilindeki değişiklikleri incelemek için bir mercek sağlar. Burada, murin ve insan timusundan yüksek kaliteli stromal hücre popülasyonlarının yanı sıra murin kemiği ve kemik iliğinden izolasyonu için adım adım protokoller sunuyoruz. Bu protokoller aracılığıyla izole edilen hücreler, yüksek kaliteli tek hücreli multiomik veri kümeleri oluşturmak için uygundur. Numune sindiriminin, hematopoietik soy tükenmesinin, FACS analizinin/sıralamasının etkileri ve bu faktörlerin tek hücreli dizileme ile uyumluluğu nasıl etkilediği burada tartışılmaktadır. Dizileme sonrası analizde başarılı ve verimsiz ayrışmayı ve aşağı akış stromal hücre verimlerini gösteren FACS profilleri örnekleri ile kullanıcılar için tanınabilir işaretçiler sağlanmaktadır. Stromal hücrelerin özel gereksinimlerini göz önünde bulundurmak, bu alandaki bilgiyi ilerletebilecek yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.
Introduction
Sağlıklı yetişkinde, de novo kan hücrelerinin üretimi kemik iliğinde ve timusta gerçekleşir. Bu bölgelerdeki stromal hücreler hematopoezin sürdürülmesi için gereklidir, ancak stroma dokunun %1’inden daha azını oluşturur 1,2,3,4. Bu nedenle, stroma’yı destekleyen saf hematopoez izolatlarının elde edilmesi, özellikle yüksek kalitede numuneler elde etmek için uygun işleme gerektiren tek hücreli multiomikler için önemli bir zorluk teşkil eder. Farklı sindirim kokteyllerinin bileşenleri, multiomik analizdeki belirli adımlara müdahale edebilir 5,6. Burada sunulan protokoller, kemik iliği ve timik dokulardan çok çeşitli stromal hücrelerin izolasyonunu detaylandırmaktadır.
Hem kemik iliği hem de timustaki stromal bileşenlerin bozulması, kan hücresi gelişiminde derin bozulmaya neden olur ve malignitelere neden olabilir 7,8,9. Stromayı destekleyen hematopoez, sitotoksik koşullandırma ve kemik iliği transplantasyonunu takiben hasar görür ve bu da hematopoietik kök ve progenitör hücreleri (HSPC’ler) sürdüren sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin salgılanmasının azalmasına neden olur2,10,11. Ayrıca, yaşlanma kemik iliği ve timus stromal hücrelerini etkiler ve muhtemelen yaşlı hematopoietik fenotiplere katkıda bulunur. Timus, yaşa bağlı geniş evrim geçiren ilk organdır. Yağ ve fibrotik doku, ergenliğin başlangıcında T hücreli destekleyici stromanın yerini almaya başlar12,13. Kemik iliğinde adiposit içeriği yaşla birlikte artar ve vasküler ve endosteal nişler önemli ölçüde yeniden şekillenir 14,15,16.
Hematopoezi destekleyici stromanın çoklu stres durumlarında ve hem insan hem de murin dokusunun timus durumunda çalışmasını sağlamak için, daha önce yayınlanmış sindirim protokollerinioptimize ettik 1,2,8,17,18. Bu protokoller, hücrelerin verimli ve tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve diğer multiomik türleri ile uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hematopoetik organlardaki stromal hücreler normal kan üretimi için kritik öneme sahiptir ve hematopoietik stroma bozulmaları hematopoietik bakımda ve strese yanıtta ciddi bozulmalara neden olabilir 9,23,24. Hematopoietik stromal hücrelere ilişkin içgörü, hematolojik hastalıklarıanlamak 7,9,10,24 ve bunlarla savaşmak için terapötikler geliştirme yeteneğ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Massachusetts General Hospital’daki HSCI-CRM Akış Sitometrisi tesisi ve Harvard Üniversitesi’ndeki Bauer Core Tesisi tarafından uzman teknik yardımla desteklendik. T.K ve K. G, İsveç Araştırma Konseyi ve C.M. Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklendi. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizindeki yardımları için Sergey Isaev ve I-Hsiu Lee’ye teşekkür ederiz.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
