Stromale celisolatie van hematopoëtische organen
Summary
Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.
Abstract
Single-cell sequencing heeft het mogelijk gemaakt om heterogene celpopulaties in het stroma van hematopoëtische organen in kaart te brengen. Deze methodologieën bieden een lens waarmee eerder onopgeloste heterogeniteit bij steady state kan worden bestudeerd, evenals veranderingen in de representatie van celtypen veroorzaakt door extrinsieke spanningen of tijdens veroudering. Hier presenteren we stapsgewijze protocollen voor de isolatie van hoogwaardige stromale celpopulaties uit muizen en menselijke thymus, evenals muizenbot en beenmerg. Cellen die via deze protocollen zijn geïsoleerd, zijn geschikt voor het genereren van hoogwaardige single-cell multiomics-datasets. De effecten van monstervergisting, uitputting van hematopoëtische afstamming, FACS-analyse/sortering en hoe deze factoren de compatibiliteit met single-cell sequencing beïnvloeden, worden hier besproken. Met voorbeelden van FACS-profielen die wijzen op succesvolle en inefficiënte dissociatie en stroomafwaartse stromale celopbrengsten in post-sequencing-analyse, worden herkenbare aanwijzingen voor gebruikers gegeven. Het is van cruciaal belang om rekening te houden met de specifieke vereisten van stromale cellen voor het verkrijgen van hoogwaardige en reproduceerbare resultaten die de kennis in het veld kunnen bevorderen.
Introduction
Bij de gezonde volwassene vindt de novo productie van bloedcellen plaats in het beenmerg en de thymus. Stromale cellen op deze plaatsen zijn essentieel voor het behoud van hematopoëse, maar stroma vormt minder dan 1% van het weefsel 1,2,3,4. Het verkrijgen van zuivere isolaten van hematopoëse-ondersteunend stroma vormt daarom een aanzienlijke uitdaging, met name voor eencellige multiomics die een snelle verwerking vereisen om monsters van hoge kwaliteit te verkrijgen. Componenten van verschillende spijsverteringscocktails kunnen bepaalde stappen in multiomics-analyse verstoren 5,6. De hier gepresenteerde protocollen beschrijven de isolatie van een grote verscheidenheid aan stromale cellen uit beenmerg- en thymusweefsel.
Verstoringen van stromale bestanddelen in zowel het beenmerg als de thymus leiden tot een ernstige verstoring van de ontwikkeling van bloedcellen en kunnen leiden tot maligniteiten 7,8,9. Hematopoëse-ondersteunend stroma is beschadigd na cytotoxische conditionering en beenmergtransplantatie, wat resulteert in verminderde secretie van cytokinen en groeifactoren die hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC’s) ondersteunen2,10,11. Bovendien beïnvloedt veroudering de stromale cellen van het beenmerg en de thymus, wat waarschijnlijk bijdraagt aan verouderde hematopoëtische fenotypes. De thymus is het eerste orgaan dat uitgebreide leeftijdsgebonden involutie ondergaat. Vet en fibrotisch weefsel beginnen al bij het begin van de puberteit met het vervangen van T-celondersteunend stroma12,13. In het beenmerg neemt het gehalte aan adipocyten toe met de leeftijd en worden de vasculaire en endosteale niches aanzienlijk geremodelleerd 14,15,16.
Om studie van hematopoëse-ondersteunend stroma in meerdere stresstoestanden mogelijk te maken en in het geval van de thymus van zowel menselijk als muizenweefsel, hebben we eerder gepubliceerde spijsverteringsprotocollen geoptimaliseerd 1,2,8,17,18. Deze protocollen zorgen voor een efficiënte en reproduceerbare isolatie van cellen en zijn compatibel met single-cell RNAsequencing (scRNAseq) en andere soorten multiomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stromale cellen in hematopoëtische organen zijn van cruciaal belang voor een normale bloedproductie en hematopoëtische stromaverstoringen kunnen leiden tot ernstige stoornissen in het hematopoëtisch onderhoud en de reactie op stress 9,23,24. Inzicht in hematopoëtische stromale cellen is essentieel voor het begrijpen van hematologische ziekten 7,9,10,24 en voor het vermogen om therapieën te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We werden ondersteund met deskundige technische assistentie door de HSCI-CRM flowcytometrie-faciliteit in het Massachusetts General Hospital en de Bauer Core Facility van de Harvard University. T.K. en K.G werden gesteund door de Zweedse Onderzoeksraad en C.M. door de Duitse Stichting voor Onderzoek. We danken Sergey Isaev en I-Hsiu Lee voor hun hulp bij de analyse van single-cell RNA-sequencinggegevens.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
