Summary

Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

Abstract

La secuenciación unicelular ha permitido el mapeo de poblaciones celulares heterogéneas en el estroma de los órganos hematopoyéticos. Estas metodologías proporcionan una lente a través de la cual estudiar la heterogeneidad no resuelta previamente en estado estacionario, así como los cambios en la representación del tipo de célula inducidos por tensiones extrínsecas o durante el envejecimiento. Aquí, presentamos protocolos paso a paso para el aislamiento de poblaciones de células estromales de alta calidad de timo murino y humano, así como de hueso murino y médula ósea. Las celdas aisladas a través de estos protocolos son adecuadas para generar conjuntos de datos multiómicos de una sola celda de alta calidad. Aquí se analizan los impactos de la digestión de la muestra, el agotamiento del linaje hematopoyético, el análisis/clasificación FACS y cómo estos factores influyen en la compatibilidad con la secuenciación de una sola célula. Con ejemplos de perfiles FACS que indican una disociación exitosa e ineficiente y rendimientos de células estromales aguas abajo en el análisis posterior a la secuenciación, se proporcionan indicadores reconocibles para los usuarios. Tener en cuenta los requisitos específicos de las células estromales es crucial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad que puedan avanzar en el conocimiento en el campo.

Introduction

En el adulto sano, la producción de novo de células sanguíneas se produce en la médula ósea y el timo. Las células estromales en estos sitios son esenciales para el mantenimiento de la hematopoyesis, pero el estroma constituye menos del 1% del tejido 1,2,3,4. Por lo tanto, la obtención de aislados puros de estroma portador de hematopoyesis constituye un desafío importante, particularmente para la multiómica unicelular que requiere un procesamiento oportuno para obtener muestras de alta calidad. Los componentes de diferentes cócteles de digestión pueden interferir con ciertos pasos en el análisis multiómico 5,6. Los protocolos presentados aquí detallan el aislamiento de una amplia variedad de células estromales de la médula ósea y los tejidos tímicos.

Las perturbaciones de los constituyentes estromales tanto en la médula ósea como en el timo dan lugar a una profunda alteración en el desarrollo de las células sanguíneas y pueden dar lugar a neoplasias malignas 7,8,9. El estroma portador de la hematopoyesis se daña después del condicionamiento citotóxico y el trasplante de médula ósea, lo que resulta en una reducción de la secreción de citocinas y factores de crecimiento que sostienen las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)2,10,11. Además, el envejecimiento afecta a las células estromales de la médula ósea y el timo, lo que probablemente contribuya al envejecimiento de los fenotipos hematopoyéticos. El timo es el primer órgano que sufre una involución extensa asociada a la edad. La grasa y el tejido fibrótico comienzan a reemplazar al estroma de soporte de las células T desde el inicio de la pubertad12,13. En la médula ósea, el contenido de adipocitos aumenta con la edad y los nichos vascular y endosteal se remodelan significativamente 14,15,16.

Para permitir el estudio del estroma de soporte de hematopoyesis en múltiples estados de estrés y en el caso del timo tanto de tejido humano como murino, hemos optimizado los protocolos de digestión publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Estos protocolos garantizan un aislamiento eficiente y reproducible de las células, y son compatibles con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y otros tipos de multiómicas.

Protocol

Todo el trabajo con tejido humano se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Interna (IRB) del Hospital General de Massachusetts. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones C57Bl/6, de 8 a 10 semanas de edad, machos y hembras. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales<…

Representative Results

Estos protocolos producen variedades de células estromales reproducibles del timo y la médula ósea adecuadas para el análisis de citometría de flujo, así como multiómicas de una sola célula, como la secuenciación de SCRNA. El tejido tímico murino experimenta una remodelación significativa en respuesta a factores estresantes, como el condicionamiento citotóxico que precede al trasplante de médula ósea o el proceso natural de envejecimiento. Como consecuencia, la celularidad tímica se reduce drásticamente e…

Discussion

Las células estromales de los órganos hematopoyéticos son fundamentales para la producción normal de sangre y las perturbaciones del estroma hematopoyético pueden dar lugar a graves deficiencias en el mantenimiento hematopoyético y en la respuesta al estrés 9,23,24. El conocimiento de las células estromales hematopoyéticas es esencial para la comprensión de las enfermedades hematológicas <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Contamos con el apoyo de la asistencia técnica experta del centro de citometría de flujo HSCI-CRM del Hospital General de Massachusetts y del centro Bauer Core de la Universidad de Harvard. T.K y K.G contaron con el apoyo del Consejo Sueco de Investigación y C.M. de la Fundación Alemana de Investigación. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee por su ayuda en el análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D) BD Biosciences 559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC BD Biosciences 643510
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A9647
C57Bl/6 mice Jackson 664 Males or females, 8-12 weeks old
Calcein  Fisher Scientific 65-0853-78
Collagenase IV Millipore Sigma C5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm Fisher Scientific 08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) Biolegend 422801
Dispase II Thermo Fisher Scientific 17105041
Dnase I Solution Thermo Fisher Scientific 90083  2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit StemCell Technologies 19860
Fetal Bovine Serum Gibco A31605-01 Qualified One Shot
Human Fc Block BD Biosciences 564220
Liberase TM  Millipore Sigma 5401127001 Research Grade
Medium 199 Gibco 12350
Mouse anti-human CD235a-BV77 BD Biosciences 740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 Biolegend 303130
Mouse anti-human CD45-BV77 Biolegend 304050
Mouse anti-human CD4-BV605 BD Biosciences 562658
Mouse anti-human CD66b-FITC BD Biosciences 555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 BD Biosciences 557760
Mouse anti-human EpCam-BV421 Biolegend 324220
Protector RNase Inhibitor Millipore Sigma 3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 Biolegend 120424
Rat anti-mouse CD11b-Biotin Biolegend 101204
Rat anti-mouse CD140a-APC Fisher Scientific 17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Biosciences 553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737 BD Biosciences 612802
Rat anti-mouse CD31-BV421 Biolegend 102424
Rat anti-mouse CD3-Biotin Biolegend 100244
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin Biolegend 109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 Biolegend 103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 Biolegend 103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin Biolegend 103204
Rat anti-mouse CD51-PE Biolegend 104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711 BD Biosciences 563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 Biolegend 108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin Biolegend 108404
Rat anti-mouse Ter119-Biotin Biolegend 116204
Rat anti-mouse Ter119-PE Biolegend 116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 Biolegend 116222
Stemxyme  Worthington Biochemical LS004107

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Cite This Article
Kristiansen, T., Mayerhofer, C., Gustafsson, K., Scadden, D. T. Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs. J. Vis. Exp. (203), e66231, doi:10.3791/66231 (2024).

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