Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos
Summary
Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.
Abstract
La secuenciación unicelular ha permitido el mapeo de poblaciones celulares heterogéneas en el estroma de los órganos hematopoyéticos. Estas metodologías proporcionan una lente a través de la cual estudiar la heterogeneidad no resuelta previamente en estado estacionario, así como los cambios en la representación del tipo de célula inducidos por tensiones extrínsecas o durante el envejecimiento. Aquí, presentamos protocolos paso a paso para el aislamiento de poblaciones de células estromales de alta calidad de timo murino y humano, así como de hueso murino y médula ósea. Las celdas aisladas a través de estos protocolos son adecuadas para generar conjuntos de datos multiómicos de una sola celda de alta calidad. Aquí se analizan los impactos de la digestión de la muestra, el agotamiento del linaje hematopoyético, el análisis/clasificación FACS y cómo estos factores influyen en la compatibilidad con la secuenciación de una sola célula. Con ejemplos de perfiles FACS que indican una disociación exitosa e ineficiente y rendimientos de células estromales aguas abajo en el análisis posterior a la secuenciación, se proporcionan indicadores reconocibles para los usuarios. Tener en cuenta los requisitos específicos de las células estromales es crucial para obtener resultados reproducibles y de alta calidad que puedan avanzar en el conocimiento en el campo.
Introduction
En el adulto sano, la producción de novo de células sanguíneas se produce en la médula ósea y el timo. Las células estromales en estos sitios son esenciales para el mantenimiento de la hematopoyesis, pero el estroma constituye menos del 1% del tejido 1,2,3,4. Por lo tanto, la obtención de aislados puros de estroma portador de hematopoyesis constituye un desafío importante, particularmente para la multiómica unicelular que requiere un procesamiento oportuno para obtener muestras de alta calidad. Los componentes de diferentes cócteles de digestión pueden interferir con ciertos pasos en el análisis multiómico 5,6. Los protocolos presentados aquí detallan el aislamiento de una amplia variedad de células estromales de la médula ósea y los tejidos tímicos.
Las perturbaciones de los constituyentes estromales tanto en la médula ósea como en el timo dan lugar a una profunda alteración en el desarrollo de las células sanguíneas y pueden dar lugar a neoplasias malignas 7,8,9. El estroma portador de la hematopoyesis se daña después del condicionamiento citotóxico y el trasplante de médula ósea, lo que resulta en una reducción de la secreción de citocinas y factores de crecimiento que sostienen las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC)2,10,11. Además, el envejecimiento afecta a las células estromales de la médula ósea y el timo, lo que probablemente contribuya al envejecimiento de los fenotipos hematopoyéticos. El timo es el primer órgano que sufre una involución extensa asociada a la edad. La grasa y el tejido fibrótico comienzan a reemplazar al estroma de soporte de las células T desde el inicio de la pubertad12,13. En la médula ósea, el contenido de adipocitos aumenta con la edad y los nichos vascular y endosteal se remodelan significativamente 14,15,16.
Para permitir el estudio del estroma de soporte de hematopoyesis en múltiples estados de estrés y en el caso del timo tanto de tejido humano como murino, hemos optimizado los protocolos de digestión publicados anteriormente 1,2,8,17,18. Estos protocolos garantizan un aislamiento eficiente y reproducible de las células, y son compatibles con la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq) y otros tipos de multiómicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células estromales de los órganos hematopoyéticos son fundamentales para la producción normal de sangre y las perturbaciones del estroma hematopoyético pueden dar lugar a graves deficiencias en el mantenimiento hematopoyético y en la respuesta al estrés 9,23,24. El conocimiento de las células estromales hematopoyéticas es esencial para la comprensión de las enfermedades hematológicas <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contamos con el apoyo de la asistencia técnica experta del centro de citometría de flujo HSCI-CRM del Hospital General de Massachusetts y del centro Bauer Core de la Universidad de Harvard. T.K y K.G contaron con el apoyo del Consejo Sueco de Investigación y C.M. de la Fundación Alemana de Investigación. Agradecemos a Sergey Isaev e I-Hsiu Lee por su ayuda en el análisis de los datos de secuenciación de ARN de una sola célula.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
