Aislamiento de células estromales de órganos hematopoyéticos

Todo el trabajo con tejido humano se llevó a cabo después de la aprobación de la Junta de Revisión Interna (IRB) del Hospital General de Massachusetts. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. Para el presente estudio se utilizaron ratones C57Bl/6, de 8 a 10 semanas de edad, machos y hembras. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). 1. Preparación del tejido tímico murino Prepare los siguientes tampones y soluciones.Medio 199 (M199) con 2% (v/v) de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales). Cóctel de disociación murina: 0,5 WU/mL Liberase TM y 6,3 U/mL de DNasa I en M199 + 2% FBS (ver Tabla de Materiales). M199 con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA).NOTA: El medio que contiene FBS se puede cambiar a BSA para mejorar la calidad del ARN. Realizar la disección del timo murinoEutanasiar al ratón por asfixia con CO2 (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) y colocarlo boca arriba. Humedece el pelaje del pecho rociando etanol al 70% y procede a abrir la cavidad torácica. Disecciona cuidadosamente el timo haciendo primero una incisión transversal justo debajo de la caja torácica con unas tijeras quirúrgicas. Corta las costillas a cada lado del ratón hasta la clavícula. A continuación, corte el diafragma para que se pueda liberar la pared torácica. Levante las costillas con un par de pinzas para exponer la cavidad torácica.El timo es un órgano blanco y bilobular, situado en la parte superior de la cavidad, justo encima del corazón. Sostenga el timo con las pinzas y corte suavemente el tejido conectivo que mantiene el timo en su lugar. Coloque el tejido tímico disecado en el pocillo de una placa de 6 pocillos con M199 + 2% de FBS en hielo.NOTA: Cuando se trabaja con ratones envejecidos o condicionados por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos, el timo puede ser tan pequeño que se requiere un microscopio de disección para extirpar el órgano de manera confiable. Con un microscopio de disección, extraiga cualquier tejido extratímico con pinzas de punta roma y tijeras de microresorte. Realizar la disociación enzimática del tejido tímico murino (30 min en incrementos de 10 min)Coloque el timo limpio en la tapa de un tubo de 15 ml y pique finamente el tejido con tijeras quirúrgicas estériles.NOTA: Picar el tejido en la tapa del tubo que se va a utilizar para la digestión minimiza la pérdida de tejido debido a la transferencia de un recipiente a otro. Esto es muy importante cuando se trabaja con ratones envejecidos o condicionados por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos. El pequeño tamaño del timo en estos entornos requiere la necesidad de reducir la pérdida de material siempre que sea posible. Agregue 2 mL de cóctel de disociación murina al tubo de 15 mL, coloque la tapa que contiene las piezas de timo e invierta 5 veces para asegurar que el tejido se resuspenda en el cóctel de disociación. Para evitar fugas, envuelva la tapa del tubo en una película de parafina. A continuación, coloque el tubo horizontalmente en un baño de agua a 37 °C con agitación a 250 rpm. Incubar durante 10 min.NOTA: El éxito del protocolo de digestión depende de que la incubación se realice a 37 °C y con agitación. El protocolo descrito se ha optimizado mediante un baño de agua agitado. Si eso no está disponible, otros enfoques que permiten la agitación en un entorno caliente podrían funcionar, pero recomendamos que el protocolo se optimice primero para estos ajustes. Coloque el tubo de 15 ml en una rejilla y deje que los trozos de tejido se asienten. Retire con cuidado el sobrenadante y páselo por un colador de células de 70 μm en un tubo de 50 ml helado. Repita los pasos 2-4 dos veces para un total de 3 rondas de digestión. El tejido debe estar más o menos completamente disociado al final de la última incubación. Añadir 20 mL de M199 + 2% de FBS a la suspensión celular recogida. Girar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en un volumen adecuado de M199 + 2% FBS. A continuación, proceda al recuento de células.NOTA: El volumen de M199 + 2% FBS a resuspender dependerá del estado del timo. Para ratones de 6-10 semanas de edad, recomendamos resuspender el tejido en 3-4 mL de M199 + 2% de FBS. Sin embargo, para los experimentos en los que se utiliza tejido envejecido o condicionado por radiación o cepas mutantes con defectos tímicos, el pequeño tamaño del timo requerirá volúmenes más bajos que oscilan entre 0,1 y 1 mL. Cuente las células diluyendo la suspensión celular 1:2 en una solución de azul de tripano al 0,4% (p/v). Cargue las células en un hemocitómetro y cuente bajo un microscopio de campo claro. Cuente las células sin teñir para determinar el número de células vivas por mililitro y el número de células teñidas de azul para evaluar la viabilidad de la muestra. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del estroma tímico murinoCentrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender células a una concentración de 5 x 107 células/mL en M199 + 2% FBS suplementado con 25 U/mL de inhibidor de la ARNasa Protector (ver Tabla de Materiales). Añadir bloque murino de Fc (ver Tabla de Materiales) a una concentración de 2 μg/mL e incubar durante 10 min a 4 °C. Teñir las células con los siguientes anticuerpos: CD45-PE/Cy7 (4 μg/mL), Ter119-PE (4 μg/mL), CD31-BUV737 (2 μg/mL) y EpCam-BV711 (2 μg/mL) (ver Tabla de Materiales) durante 30 min a 4 °C. Lavar las muestras en M199 + 2% BSA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en M199 + 2% BSA que contengan un colorante de viabilidad como DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL) (ver Tabla de Materiales). Proceder al aislamiento FACS de las células estromales tímicas siguiendo los protocolos establecidos19. 2. Preparación del tejido tímico humano Prepare los siguientes tampones y soluciones.Medio 199 (M199) con 2% (v/v) FBS. M199 con 1,5% (p/v) de BSA. Cóctel de disociación humana: 1 mg/ml de colagenasa IV y 2 mg/mL de dispasa y 6,3 U/mL de DNasa I en M199 +1,5% BSA (ver Tabla de Materiales).NOTA: El último paso de la digestión en la preparación del tejido tímico humano incluye la tripsina. Por lo tanto, es esencial que todos los pasos hasta ese momento se lleven a cabo en BSA que contenga tampón, ya que FBS inhibirá la actividad de la tripsina. Realizar el aislamiento de tejido tímico humanoColoque el timo humano (recolectado siguiendo el método19 publicado anteriormente) en un volumen adecuado de M199 + 1.5% BSA y guárdelo en hielo hasta que comience el procesamiento. Al trabajar con tejido tímico humano, manéjelo como si fuera potencialmente infeccioso realizando el trabajo en una campana de cultivo de tejidos y tomando las precauciones estándar según las pautas de los CDC20. Coloque el tejido en una placa de Petri de 10 cm con 10 mL de M199 helado + 1,5% de BSA. Con pinzas y tijeras estériles, limpie cuidadosamente la grasa extratímica o el tejido que se dañó durante la extracción del órgano. Con unas tijeras quirúrgicas y un par de pinzas, corte el timo encubos de 1 cm y 3 ml y utilice el émbolo de una jeringa de 10 ml para empujar suavemente las piezas. Esto liberará algunos de los timocitos en desarrollo, reduciendo así el volumen de tejido a digerir.NOTA: Guarde la fracción hematopoyética liberada si es necesario un análisis posterior de las etapas de desarrollo de los timocitos. Sin embargo, no combine esta fracción con la fracción de células estromales generadas durante la digestión enzimática. Se observó que la agrupación de las dos fracciones aumenta significativamente el riesgo de formación de obstrucciones en la suspensión celular, lo que en última instancia reduce el rendimiento de las células estromalas. Pocas células estromales se pierden durante el suave aplastamiento del tejido. Realizar la disociación enzimática del tejido tímico humano (90 min en incrementos de 30 min)Transfiera aproximadamente 5 mg de los trozos de tejido tímico ligeramente triturados a la tapa de un tubo cónico de 50 ml. A continuación, corte el tejido finamente con unas tijeras quirúrgicas estériles. Pipetee 8 mL de cóctel de disociación humana en el tubo de 50 mL, coloque la tapa que contiene el tejido tímico humano picado y luego invierta suavemente el tubo 5 veces para asegurarse de que todo el tejido se mezcle con el cóctel de enzimas. Asegure la tapa del tubo con una película de parafina para evitar fugas. Incubar el tubo horizontalmente en un baño de agua agitado (250 rpm) a 37 °C durante 30 min. Coloque el tubo de 50 ml en una rejilla y deje que los trozos de tejido tímico humano se asienten antes de retirar el sobrenadante y pasarlo por un colador de células de 70 μm a un nuevo tubo de 50 ml colocado en hielo. Repita los pasos 2.3.2-1.3.4 para un total de dos rondas de digestión con el cóctel de disociación humana. Una vez finalizada la segunda ronda de digestión, agregue 8 ml adicionales del cóctel de disociación humana al tejido restante. A continuación, pipetee también 2 mL de tripsina al 0,25% en el tubo de disociación tisular. Incubar durante 30 minutos más a 37 °C, agitando a 250 rpm.NOTA: Es absolutamente esencial que el tiempo de digestión del tejido humano sea de al menos 90 minutos, ya que los tiempos de incubación más cortos conducen a una reducción drástica de la producción de células estromales. Una vez realizado el último paso de incubación, agrupe la suspensión celular y los fragmentos de tejido restantes con el sobrenadante recogido en los pasos anteriores pasando por un filtro de células de 70 μm. Agregue 3 mL de FBS a la muestra para romper la reacción de tripsina y colóquela en hielo. Proceda a contar las celdas como se describe en el paso 1.3. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del estroma tímico humanoCentrifugar la suspensión celular del timo humano y resuspender a una concentración de 5 x 107 células/mL en M199 + 2% FBS suplementado con 25 U/mL de inhibidor de la ARNasa Protectora. Incubar con Fc Block humano (5 μg/mL) (ver Tabla de Materiales) durante 10 min a 4 °C. Tiñir la muestra durante 30 min a 4 °C con CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL de muestra), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL de muestra), CD4-BV605 (5 μL/100 μL de muestra), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) y EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) (ver Tabla de materiales). Lavar las muestras en M199 + 1,5% BSA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en M199 + BSA al 1,5% que contengan un colorante de viabilidad como DAPI (0,5 μg/mL) o 7-AAD (1 μg/mL). Proceder al aislamiento FACS de las células estromales tímicas siguiendo los protocolos establecidos19. 3. Preparación de hueso murino y tejido de médula ósea NOTA: Las fracciones óseas y de médula ósea se preparan en dos reacciones de digestión separadas para obtener la máxima pureza de las células estromales y una disociación óptima de los tejidos. Las muestras se pueden agrupar después de los pasos de digestión para clasificarlas como un compartimento estromal. Prepare los siguientes tampones y soluciones.M199 con 2% (v/v) FBS. Cóctel de disociación Murine B&M (hueso y médula): Stemxime 2 mg/mL, Dispasa 1 mg/mL y 10 U/mL de DNasa I (ver Tabla de Materiales) en M199 +2% FBS.NOTA: Prepare la mezcla de disociación B&M fresca y mantenga la mezcla en hielo hasta su uso. M199 con 0,5% (p/v) de BSA. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 0,5% (p/v) de BSA. M199 con 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de EDTA.NOTA: El medio que contiene FBS se puede cambiar a BSA para mejorar la calidad del ARN. Realizar la separación de la médula ósea murinaEutanasia del ratón por asfixia con CO2 (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Rocíe con etanol al 70% para humedecer el pelaje. Retire con cuidado el fémur, la tibia, la pelvis y el húmero de cada lado y colóquelos en un pocillo que contenga M199 + 2% de FBS en hielo21,22. Retire todo el músculo, ligamento y tejido cartilaginoso con toallitas de papel para minimizar el daño al hueso y preservar la capa perióstica. Colóquelos en un pozo nuevo con M199 + 2% FBS en hielo. Utiliza un bisturí y corta las placas de crecimiento de los huesos largos para eliminar la epífisis y colócala en un plato de 10 cm con M199 + 2% FBS en hielo. Enjuague la médula ósea de los huesos hasta que esté de color blanco pálido. Utilice una aguja de 28 g y una jeringa de 10 ml llena de 10 ml de M199 + 2 % de FBS para enjuagar la médula en un tubo de 15 ml con hielo. Coloque el hueso enrojecido en el plato de 10 cm con la epífisis.NOTA: El lavado completo de la médula ósea para la separación completa de los tejidos dará como resultado una mejor preparación de la muestra. Realizar la disociación enzimática del tejido de la médula ósea murina (30 min en incrementos de 10 min)Deje el tubo de 15 ml en posición vertical sobre hielo hasta que la médula se hunda hasta el fondo del tubo. Retire lentamente los 10 mL de M199 + 2% de FBS mediante pipeteo. Añadir 4 mL de cóctel de disociación B&M al tubo de 15 mL y colocarlo en un baño de agua a 37 °C (sin agitar) durante 10 min. Después de 5 minutos, invierta el tubo tres veces y vuelva a colocarlo en el baño de agua. Después de los primeros 10 minutos, asegúrese de que el gránulo esté en el fondo y recoja el sobrenadante mientras se filtra a través de un colador de células de 70 μm en un tubo helado de 50 ml. Agregue 2 mL de cóctel de disociación B&M fresco al pellet BM restante y vuelva a colocarlo en el baño de agua. Disocie los restos de médula ósea mediante un pipeteo vigoroso con una pipeta de 1 ml. Recoja toda la suspensión celular resultante en el mismo tubo que en los pasos anteriores. Agregue 20 mL de M199 + 0.5% BSA + 2 mM de EDTA a la suspensión celular recolectada.NOTA: En el paso 3.3.5, el tampón añadido después de la muestra final digerida contiene EDTA para ayudar a inhibir la actividad enzimática adicional. Realizar la depleción de células hematopoyéticas del tejido de la médula ósea murina.Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender en 500 μL de PBS + 0,5% de BSA con anticuerpos de biotina (5 mg/mL) dirigidos a CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 y CD3 (ver Tabla de Materiales). Transfiera a un tubo de fondo redondo con una tapa. Incubar en un agitador orbital durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agite las perlas magnéticas a fondo y añada 25 μL de perlas magnéticas al tubo. Incubar en un agitador orbital durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Coloque el tubo en el imán correspondiente durante 2-3 minutos y recoja el sobrenadante en un tubo nuevo.NOTA: La médula ósea se puede agrupar o mantener separada de la fracción ósea después de este paso. Si el agotamiento del linaje tiene éxito, la suspensión celular resultante debe estar desprovista de glóbulos rojos. Realizar la disociación enzimática del tejido óseo murino.Rompe los huesos en pedazos más pequeños en el plato de 10 cm con el extremo plano de la tapa de un tubo de 50 mL. Filtre el sobrenadante a través de un filtro de células de 70 μm para aislar los fragmentos óseos dentro del filtro.NOTA: Alternativamente, se puede usar un mortero para la fragmentación ósea. Esta opción, sin embargo, tiende a generar más residuos y a reducir la viabilidad de las células estromales cuando el hueso está molido en lugar de romperse. Las células del estroma todavía están adheridas al hueso y dentro de él, y el sobrenadante que contiene células hematopoyéticas debe desecharse. Use unas tijeras para cortar los fragmentos de hueso en el filtro de células. Esto aumentará el área de superficie para una disociación enzimática más eficiente. Lavar el hueso con 5 mL de M199 + 2% FBS. Coloque la fracción ósea en 5 mL de mezcla murina de disociación B&M (ver Tabla de Materiales) en un tubo nuevo de 50 mL. Para evitar fugas, envuelva la tapa del tubo en una película de parafina. A continuación, coloque el tubo horizontalmente en un baño de agua a 37 °C con agitación a 120 rpm durante 30 min. Después de la digestión, añadir 25 mL de M199 + 0,5% BSA + 2 mM de EDTA y filtrar el sobrenadante que contiene las células estromales a través de un colador de células de 70 μm en un tubo helado de 50 ml.NOTA: Compruebe que los fragmentos óseos resultantes han disminuido visiblemente por la digestión. En el paso 3.5.5, el tampón añadido después de la muestra final digerida contiene EDTA para ayudar a inhibir la actividad enzimática adicional. Realizar la clasificación de células activadas por fluorescencia del hueso murino y el estroma de la médula ósea.Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender en bloque Fc murino a una concentración de 10 μg/mL en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA e incubar durante 10 min a 4 °C. Teñir las células (hasta 10 millones de células/100 μL de volumen total de tinción) con los siguientes anticuerpos: CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/dazzle (2 μg/mL) (ver Tabla de materiales). Deje que Calcein-AM se equilibre a temperatura ambiente y vuelva a suspender en 50 μL de DMSO. Prepárese fresco para cada uso. Mantener a temperatura ambiente después de la resuspensión. Diluir previamente la calceína en PBS (0,1 mg/mL) antes de añadirla a la muestra (20 μg/mL) ya resuspendida en el cóctel de tinción de anticuerpos e incubar durante 20-30 min a 4 °C en la oscuridad. Lavar las muestras en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA. Proceder al aislamiento FACS de las células estromales óseas y de médula ósea siguiendo los protocolos establecidos19.