عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم
Summary
نقدم هنا بروتوكولات تمكن من عزل الخلايا اللحمية من عظم الفئران ونخاع العظام والغدة الصعترية وأنسجة الغدة الصعترية البشرية المتوافقة مع تعدد الخلايا أحادي الخلية.
Abstract
مكن تسلسل الخلية الواحدة من رسم خرائط لمجموعات الخلايا غير المتجانسة في سدى الأعضاء المكونة للدم. توفر هذه المنهجيات عدسة يمكن من خلالها دراسة عدم التجانس الذي لم يتم حله سابقا في حالة مستقرة ، وكذلك التغيرات في تمثيل نوع الخلية الناجم عن الضغوط الخارجية أو أثناء الشيخوخة. هنا ، نقدم بروتوكولات تدريجية لعزل مجموعات الخلايا اللحمية عالية الجودة من الفئران والغدة الصعترية البشرية ، وكذلك عظام الفئران ونخاع العظام. الخلايا المعزولة من خلال هذه البروتوكولات مناسبة لإنشاء مجموعات بيانات متعددة الخلايا أحادية الخلية عالية الجودة. تتم مناقشة تأثيرات هضم العينات ، واستنفاد سلالة المكونة للدم ، وتحليل / فرز FACS ، وكيف تؤثر هذه العوامل على التوافق مع تسلسل الخلية الواحدة هنا. مع أمثلة على ملامح FACS التي تشير إلى تفكك ناجح وغير فعال وإنتاجية الخلايا اللحمية النهائية في تحليل ما بعد التسلسل ، يتم توفير مؤشرات يمكن التعرف عليها للمستخدمين. يعد النظر في المتطلبات المحددة للخلايا اللحمية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار يمكن أن تعزز المعرفة في هذا المجال.
Introduction
في البالغين الأصحاء ، يحدث إنتاج دي نوفو لخلايا الدم في نخاع العظام والغدة الصعترية. الخلايا اللحمية في هذه المواقع ضرورية للحفاظ على تكون الدم ، لكن السدى يشكل أقل من 1٪ من الأنسجة1،2،3،4. وبالتالي ، فإن الحصول على عزلات نقية من السدى الداعمة لتكوين الدم يشكل تحديا كبيرا ، خاصة بالنسبة للخلايا المتعددة أحادية الخلية التي تتطلب معالجة مناسبة للحصول على عينات عالية الجودة. قد تتداخل مكونات كوكتيلات الهضم المختلفة مع خطوات معينة في تحليل multiomics 5,6. توضح البروتوكولات المعروضة هنا بالتفصيل عزل مجموعة متنوعة من الخلايا اللحمية من نخاع العظم وأنسجة الغدة الصعترية.
تؤدي اضطرابات المكونات اللحمية في كل من نخاع العظم والغدة الصعترية إلى اضطراب عميق في نمو خلايا الدم ويمكن أن تؤدي إلى أورام خبيثة7،8،9. تتلف السدى الداعمة لتكوين الدم بعد التكييف السام للخلايا وزرع نخاع العظم ، مما يؤدي إلى انخفاض إفراز السيتوكينات وعوامل النمو التي تحافظ على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs)2،10،11. علاوة على ذلك ، تؤثر الشيخوخة على نخاع العظام وخلايا انسجة الغدة الصعترية التي من المحتمل أن تساهم في الأنماط الظاهرية المكونة للدم القديمة. الغدة الصعترية هي أول عضو يخضع لانقلاب واسع النطاق مرتبط بالعمر. تبدأ الأنسجة الدهنية والليفية في استبدال السدى الداعمة للخلايا التائية في وقت مبكر من بداية سن البلوغ 12,13. في نخاع العظام ، يزداد محتوى الخلايا الشحمية مع تقدم العمر ويتم إعادة تشكيل منافذ الأوعية الدموية والداخلية بشكل كبير14،15،16.
لتمكين دراسة السدى الداعم لتكوين الدم عبر حالات الإجهاد المتعددة وفي حالة الغدة الصعترية لكل من الأنسجة البشرية والفئران ، قمنا بتحسين بروتوكولات الهضم المنشورة مسبقا1،2،8،17،18. تضمن هذه البروتوكولات عزلا فعالا وقابلا للتكرار للخلايا ، وهي متوافقة مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وأنواع أخرى من multiomics.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتبر الخلايا اللحمية في الأعضاء المكونة للدم ضرورية لإنتاج الدم الطبيعي ويمكن أن تؤدي اضطرابات السدى المكونة للدم إلى إعاقات شديدة في صيانة المكونة للدم والاستجابة للإجهاد9،23،24. نظرة ثاقبة على الخلايا اللحمية المكونة للدم أمر ضروري لف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لقد تم دعمنا بمساعدة فنية متخصصة من قبل مرفق قياس التدفق الخلوي HSCI-CRM في مستشفى ماساتشوستس العام ومرفق باور الأساسي في جامعة هارفارد. تم دعم T.K و K. G من قبل مجلس البحوث السويدي و CM من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية. نشكر سيرجي إيساييف و I-Hsiu Lee على المساعدة في تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
