Выделение стромальных клеток из кроветворных органов
Summary
Здесь мы представляем протоколы, которые позволяют выделить стромальные клетки из костей мыши, костного мозга, тимуса и ткани тимуса человека, совместимые с мультиомикой одиночных клеток.
Abstract
Секвенирование одиночных клеток позволило картировать гетерогенные клеточные популяции в строме кроветворных органов. Эти методологии обеспечивают линзу, через которую можно изучать ранее неразрешенную гетерогенность в равновесном состоянии, а также изменения в представлении типа клеток, вызванные внешними стрессами или во время старения. Здесь мы представляем пошаговые протоколы выделения высококачественных популяций стромальных клеток из мышиной и тимуса человека, а также мышиной кости и костного мозга. Клетки, выделенные с помощью этих протоколов, подходят для создания высококачественных наборов данных мультиомики для отдельных клеток. Здесь обсуждается влияние переваривания образцов, истощения гемопоэтической линии, анализа/сортировки FACS, а также то, как эти факторы влияют на совместимость с секвенированием одиночных клеток. С примерами профилей FACS, указывающих на успешную и неэффективную диссоциацию и выход стромальных клеток ниже по потоку в анализе после секвенирования, предоставляются узнаваемые указатели для пользователей. Учет специфических требований к стромальным клеткам имеет решающее значение для получения высококачественных и воспроизводимых результатов, которые могут продвинуть знания в этой области.
Introduction
У здорового взрослого человека de novo производство клеток крови происходит в костном мозге и вилочковой железе. Стромальные клетки в этих участках необходимы для поддержания кроветворения, но строма составляет менее 1% ткани 1,2,3,4. Таким образом, получение чистых изолятов стромы, поддерживающих кроветворение, представляет собой значительную проблему, особенно для мультиомики одиночных клеток, которая требует целесообразной обработки для получения образцов высокого качества. Компоненты различных коктейлей для пищеварения могут мешать определенным этапам мультиомного анализа 5,6. Представленные здесь протоколы подробно описывают выделение широкого спектра стромальных клеток из тканей костного мозга и тимуса.
Нарушения стромальных составляющих как в костном мозге, так и в тимусе приводят к глубокому нарушению развития клеток крови и могут привести к злокачественным новообразованиям 7,8,9. Строма, поддерживающая кроветворение, повреждается после цитотоксического кондиционирования и трансплантации костного мозга, что приводит к снижению секреции цитокинов и факторов роста, поддерживающих гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (ГСК)2,10,11. Кроме того, старение влияет на стромальные клетки костного мозга и тимуса, что, вероятно, способствует старению гемопоэтических фенотипов. Тимус является первым органом, который подвергается обширной возрастной инволюции. Жировая и фиброзная ткань начинают замещать поддерживающую строму Т-клеток уже в начале периода полового созревания 12,13. В костном мозге с возрастом увеличивается содержание адипоцитов, а сосудистые и эндостальные ниши значительно ремоделируются 14,15,16.
Чтобы изучить поддерживающую строму кроветворения при множественных стрессовых состояниях и в случае тимуса как человеческой, так и мышиной ткани, мы оптимизировали ранее опубликованные протоколы пищеварения 1,2,8,17,18. Эти протоколы обеспечивают эффективную и воспроизводимую изоляцию клеток и совместимы с секвенированием РНК одиночных клеток (scRNAseq) и другими типами мультиомики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стромальные клетки в кроветворных органах имеют решающее значение для нормального производства крови, и нарушения стромы кроветворения могут привести к серьезным нарушениям поддержания кроветворения и реакции на стресс 9,23,24. Понима?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Нам оказали экспертную техническую поддержку специалисты со стороны центра проточной цитометрии HSCI-CRM в Массачусетской больнице общего профиля и центра Bauer Core Facility в Гарвардском университете. Т.К. и К.Г. были поддержаны Шведским исследовательским советом, а К.М. — Немецким научно-исследовательским обществом. Мы благодарим Сергея Исаева и И-Сю Ли за помощь в анализе данных секвенирования РНК одиночных клеток.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| 7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
| Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
| C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
| Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
| Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
| Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
| Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
| Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
| Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
| Medium 199 | Gibco | 12350 | |
| Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
| Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
| Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
| Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
| Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
| Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
| Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
| Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
| Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
| Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
| Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
| Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
| Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
| Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
| Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
| Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
| Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
| Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
| Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
| Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
| Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
| Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
| Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
References
- Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
- Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
- Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
- Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).
- Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
- Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
- Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
- Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
- Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
- Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
- Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
- Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
- Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951 (2013).
- Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936 (2016).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
- Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
- Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
- O’flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).
