Использование визуализации живых клеток для измерения влияния патологических белков на аксональный транспорт в первичных нейронах гиппокампа

Нейроны зависят от двунаправленного транспорта груза вдоль аксона для поддержания функциональных синапсов и нейронных связей. Считается, что дефицит аксонального транспорта является важнейшим фактором патогенеза нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (БА) и другие таупатии, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона ^1,2,3. Действительно, патологические модификации нескольких белков, связанных с заболеванием, негативно влияют на транспорт (рассмотрено в ^{пункте 4}). Разработка методов исследования механизмов, с помощью которых патологические белки оказывают токсичное воздействие на заболевание, необходима для понимания нейродегенеративных расстройств и определения потенциальных мишеней для терапевтического вмешательства.

Несколько важных открытий о транспорте аксонов, включая открытие обычного кинезина, киназо- и фосфатазозависимых путей, регулирующих моторные белки, и механизмов, с помощью которых патологические белки нарушают регуляцию транспорта аксонов, были сделаны с использованием модели изолированной аксоплазмы кальмара ^4,5. Перфузия аксоплазмы кальмара с патологическими формами тау-белка ингибирует антероградный быстрый аксональный транспорт (FAT), эффект, зависящий от экспозиции фосфатазоактивирующего домена тау, который активирует протеинфосфатазу 1 (PP1)^6,7,8. PP1 активирует гликогенсинтазукиназу 3 (GSK3), которая, в свою очередь, фосфорилирует легкие цепи кинезинов, вызывающие высвобождение груза. Еще одним патологическим белком при БА является амилоид-β. Олигомерные формы амилоид-β ингибируют двунаправленный FAT через казеинкиназу 2, которая фосфорилирует кинезиновые легкие цепи⁹. Кроме того, патологический белок гентингтин, содержащий полиглутаминовую экспансию, и семейный ALS-связанный мутант SOD1 нарушают аксональный транспорт в аксоплазме кальмара через активность c-Jun N-концевой киназы и митоген-активируемой протеинкиназы p38, соответственно^10,11.

В то время как модель аксоплазмы кальмара продолжает оставаться ценным инструментом в понимании влияния патологических белков на аксональный транспорт, ограниченный доступ к оборудованию и образцам не позволяет ее более широко использовать. Мы разработали транспортный анализ с использованием конфокальной микроскопии живых клеток первичных нейронов первичных нейронов грызунов (мышей и крыс). Эта модель представляет собой легко адаптируемый и манипулируемый подход на основе нейронов млекопитающих с использованием широко доступных источников клеток и систем микроскопии. Например, различные патологические белки (например, содержащие модификации, связанные с заболеванием) экспрессируются для определения того, как специфические модификации этих белков влияют на транспорт в аксонах. Аналогичным образом, для изучения специфических для груза изменений можно использовать различные флуоресцентно помеченные грузовые белки. Более того, лежащие в основе молекулярные механизмы относительно легко изучаются путем нацеливания на экспрессию (т.е. нокдаун или сверхэкспрессию) выбранных белков, которые могут опосредуть эти эффекты. Этот метод также легко адаптируется для первичных нейронов, полученных из широкого спектра животных моделей.

Мы представляем подробный протокол, описывающий анализ транспорта аксонов живых клеток, который ранее использовался в первичных нейронах гиппокампа, чтобы показать, что мутантные тау-белки, связанные с лобно-височной деменцией (FTLD; P301L или R5L tau) увеличивают частоту пауз флуоресцентно меченных грузовых белков в двух направлениях¹². Кроме того, нокдаун изоформы PP1γ спас эффекты паузы¹². Это обеспечивает поддержку модели патологического тау-индуцированного разрушения, которое опосредовано аберрантной активацией сигнального пути, инициированного PP1, как описано выше ^6,7,12. В отдельном исследовании мы показали, что псевдофосфорилирование тау в S199/S202/T205 (патогенный фосфоэпитоп AT8, актуальный для таупатий) увеличивает частоту паузы в грузе и скорость антероградного сегмента. Эти эффекты зависели от N-концевого фосфатаза, активирующего домен^тау-13. Эти примеры подчеркивают полезность данной модели для определения механизмов того, как патологические белки нарушают транспорт аксонов в нейронах млекопитающих.

В этой статье представлено подробное описание метода, начиная с забора, диссоциации и культивирования первичных нейронов гиппокампа мыши, за которым следует трансфекция нейронов белками-грузами, слитыми с флуоресцентным белком, и, наконец, подход к визуализации живых клеток и анализу изображений. В качестве примера мы демонстрируем, как этот метод используется для изучения влияния модифицированного тау-белка на двунаправленный транспорт белка, связанного с везикулами, синаптофизина. Тем не менее, существует гибкость в интересующем патогенном белке и белке транспортного груза, что делает этот подход к изучению аксонального транспорта универсальным.