Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

I neuroni dipendono dal trasporto bidirezionale del carico lungo l’assone per mantenere le sinapsi funzionali e la connettività neurale. Si ritiene che i deficit del trasporto assonale contribuiscano in modo critico alla patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e altre taupatie, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e la malattia di Huntington ^1,2,3. Infatti, le modifiche patologiche di diverse proteine correlate alla malattia influenzano negativamente il trasporto (rivisto in ⁴). Lo sviluppo di metodi per studiare i meccanismi attraverso i quali le proteine patologiche esercitano tossicità nella malattia è necessario per comprendere i disturbi neurodegenerativi e identificare potenziali bersagli per l’intervento terapeutico.

Diverse importanti intuizioni sul trasporto degli assoni, tra cui la scoperta della chinesina convenzionale, le vie dipendenti dalla chinasi e dalla fosfatasi che regolano le proteine motorie e i meccanismi attraverso i quali le proteine patologiche interrompono la regolazione del trasporto degli assoni, sono state fatte utilizzando il modello^di assoplasma isolato del calamaro ^4,5. La perfusione dell’assoplasma di calamaro con forme patologiche della proteina tau inibisce il trasporto assonale veloce anterogrado (FAT), un effetto dipendente dall’esposizione del dominio attivante la fosfatasi della tau, che attiva la proteina fosfatasi 1 (PP1)^6,7,8. PP1 attiva la glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3), che a sua volta fosforila le catene leggere chinesine causando il rilascio di carico. Un’altra proteina patologica nell’AD è l’amiloide-β. Le forme oligomeriche di amiloide-β inibiscono la FAT bidirezionale attraverso la caseina chinasi 2, che fosforila le catene leggere della chinesina⁹. Inoltre, la proteina huntingtina patologica che ospita un’espansione della poliglutammina e un mutante SOD1 familiare legato alla SLA interrompono il trasporto assonale nell’assoplasma del calamaro attraverso l’attività della chinasi N-terminale c-Jun e della proteina chinasi attivata dal mitogeno p38, rispettivamente^10,11.

Mentre il modello dell’assoplasma del calamaro continua ad essere uno strumento prezioso per comprendere gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale, l’accesso limitato all’attrezzatura e ai campioni ne impedisce un uso più ampio. Abbiamo sviluppato un saggio di trasporto utilizzando l’imaging al microscopio confocale su cellule vive di neuroni primari di roditori (topo e ratto). Questo modello rappresenta un approccio basato sui neuroni dei mammiferi facilmente adattabile e manipolabile utilizzando sorgenti cellulari e sistemi di microscopia ampiamente disponibili. Ad esempio, una varietà di proteine patologiche (ad esempio, che ospitano modifiche correlate alla malattia) sono espresse per identificare come specifiche modifiche di queste proteine influenzano il trasporto negli assoni. Allo stesso modo, una varietà di proteine cargo marcate in fluorescenza possono essere utilizzate per esaminare i cambiamenti specifici del carico. Inoltre, i meccanismi molecolari sottostanti sono studiati in modo relativamente semplice prendendo di mira l’espressione (cioè knockdown o sovraespressione) di proteine selezionate che possono mediare questi effetti. Questo metodo è anche facilmente adattabile per i neuroni primari derivati da un’ampia varietà di modelli animali.

Presentiamo un protocollo dettagliato che descrive il saggio di trasporto degli assoni su cellule vive precedentemente utilizzato nei neuroni primari dell’ippocampo per dimostrare che le proteine tau mutanti associate alle demenze lobari frontotemporali (FTLD; P301L o R5L tau) aumentano bidirezionalmente la frequenza di pausa delle proteine cargo marcate in fluorescenza¹². Inoltre, il knockdown dell’isoforma PP1γ ha salvato gli effetti di pausa¹². Ciò fornisce supporto al modello di interruzione patologica indotta dalla tau che è mediata attraverso l’attivazione aberrante di una via di segnalazione avviata da PP1 come descritto sopra ^6,7,12. In uno studio separato, abbiamo dimostrato che la pseudofosforilazione di tau a S199/S202/T205 (il fosfoepitopo patogeno AT8 rilevante per le taupatie) aumenta la frequenza di pausa del carico e la velocità del segmento anterogrado. Questi effetti dipendevano dal dominio di attivazione della fosfatasi N-terminale della tau¹³. Questi esempi evidenziano l’utilità di questo modello per identificare i meccanismi di come le proteine patologiche interrompono il trasporto degli assoni nei neuroni dei mammiferi.

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del metodo a partire dalla raccolta, dissociazione e coltura dei neuroni primari dell’ippocampo di topo, seguita dalla trasfezione dei neuroni con proteine cargo fuse con una proteina fluorescente e, infine, l’approccio di imaging e analisi delle immagini su cellule vive. Dimostriamo come questo metodo venga utilizzato per studiare gli effetti della tau modificata sul trasporto bidirezionale della proteina associata alla vescicola, la sinaptofisina, ad esempio. Tuttavia, c’è flessibilità nella proteina patogena e nella proteina del carico di trasporto di interesse, il che rende questo approccio versatile per studiare il trasporto assonale.