استخدام تصوير الخلايا الحية لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحصينية الأولية
Summary
نوضح هنا كيفية الجمع بين نقل الخلايا العصبية للقوارض الحصين الأولية مع التصوير البؤري للخلايا الحية لتحليل التأثيرات المرضية التي يسببها البروتين على النقل المحوري وتحديد المسارات الميكانيكية التي تتوسط هذه الآثار.
Abstract
يعد النقل ثنائي الاتجاه للشحنات على طول المحور العصبي أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي والخلايا العصبية السليمة. يتعطل النقل المحوري في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، وتكون الخلايا العصبية الإسقاطية معرضة بشكل خاص بسبب الحاجة إلى نقل المواد الخلوية لمسافات طويلة والحفاظ على كتلة محورية كبيرة. تؤثر التعديلات المرضية للعديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل ، بما في ذلك تاو ، β الأميلويد ، α-سينوكلين ، ديسموتاز الفائق الأكسيد ، وهنتنغتين ، مما يوفر آلية مشتركة محتملة تمارس من خلالها البروتينات المرضية سمية في المرض. طرق لدراسة هذه الآليات السامة ضرورية لفهم الاضطرابات التنكسية العصبية وتحديد التدخلات العلاجية المحتملة.
هنا ، يتم نقل الخلايا العصبية الحصين للقوارض الأولية المستزرعة مع بلازميدات متعددة لدراسة آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري السريع باستخدام التصوير البؤري للخلايا الحية لبروتينات الشحن الموسومة بالفلورسنت. نبدأ بحصاد وتفكك وزراعة الخلايا العصبية الحصين الأولية من القوارض. بعد ذلك ، نشارك في نقل الخلايا العصبية باستخدام تركيبات الحمض النووي البلازميد للتعبير عن بروتين الشحن الموسوم بالفلورسنت والنوع البري أو الطافر تاو (يستخدم كنموذج للبروتينات المرضية). يتم تحديد المحاور العصبية في الخلايا الحية باستخدام جسم مضاد يربط مجالا خارج الخلية من اللفافة العصبية ، وهو بروتين المقطع الأولي للمحور العصبي ، ويتم تصوير المنطقة المحورية ذات الأهمية لقياس نقل البضائع الفلورية.
باستخدام KymoAnalyzer ، وهو ماكرو ImageJ متاح مجانا ، نقوم بتوصيف السرعة وتردد الإيقاف المؤقت وكثافة الشحن الاتجاهية للنقل المحوري ، وكلها قد تتأثر بوجود البروتينات المرضية. من خلال هذه الطريقة ، نحدد النمط الظاهري لزيادة تردد توقف البضائع المرتبط بالتعبير عن بروتين تاو المرضي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة تركيبات shRNA لإسكات الجينات إلى مزيج النقل لاختبار دور البروتينات الأخرى في التوسط في تعطيل النقل. هذا البروتوكول قابل للتكيف بسهولة للاستخدام مع البروتينات الأخرى المرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية وهو طريقة قابلة للتكرار لدراسة آليات كيفية تعطيل هذه البروتينات للنقل المحوري.
Introduction
تعتمد الخلايا العصبية على النقل ثنائي الاتجاه للبضائع على طول المحور العصبي للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية والاتصال العصبي. يعتقد أن عجز النقل المحوري مساهم حاسم في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) واعتلالات التاوباثيات الأخرى ، ومرض باركنسون ، والتصلب الجانبي الضموري ، ومرض هنتنغتون1،2،3. في الواقع ، تؤثر التعديلات المرضية على العديد من البروتينات المرتبطة بالأمراض سلبا على النقل (تمت مراجعته في 4). من الضروري تطوير طرق للتحقيق في الآليات التي تمارس بها البروتينات المرضية السمية في المرض لفهم الاضطرابات التنكسية العصبية وتحديد الأهداف المحتملة للتدخل العلاجي.
تم إجراء العديد من الأفكار المهمة حول نقل المحور العصبي ، بما في ذلك اكتشاف الكينيسين التقليدي ، والمسارات المعتمدة على الكيناز والفوسفاتيز التي تنظم البروتينات الحركية ، والآليات التي تعطل بها البروتينات المرضية تنظيم نقل المحور العصبي ، باستخدام نموذج أكسوبلازم الحبارالمعزول 4,5. إن نضح أكسوبلازم الحبار مع الأشكال المرضية لبروتين تاو يمنع النقل المحوري السريع المتقدم (FAT) ، وهو تأثير يعتمد على التعرض لمجال تنشيط الفوسفاتيز في تاو ، والذي ينشط بروتين الفوسفاتيز 1 (PP1) 6،7،8. PP1 ينشط الجليكوجين سينسيز كيناز 3 (GSK3) ، والذي بدوره يفسفر سلاسل ضوء كينيسين مما يتسبب في إطلاق البضائع. بروتين مرضي آخر في مرض الزهايمر هو الأميلويد β. تمنع الأشكال قليلة القسيمات من الأميلويد β الدهون ثنائية الاتجاه من خلال الكازين كيناز 2 ، الذي يفسفر سلاسل ضوء كينيسين9. علاوة على ذلك ، فإن بروتين هنتنغتين المرضي الذي يؤوي توسعا متعدد الجلوتامين ومتحولا عائليا مرتبطا بالتصلب الجانبي الضموري SOD1 يعطل كل منهما النقل المحوري في أكسوبلازم الحبار من خلال كيناز c-Jun N-terminal ونشاط بروتين كيناز المنشط بالميتوجين p38 ، على التوالي10,11.
في حين أن نموذج أكسوبلازم الحبار لا يزال أداة قيمة في فهم آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري ، فإن الوصول المحدود إلى المعدات والعينات يمنعها من استخدامها على نطاق أوسع. قمنا بتطوير مقايسة النقل باستخدام التصوير المجهري متحد البؤر للخلايا الحية للخلايا العصبية الأولية للقوارض (الفئران والفئران). يمثل هذا النموذج نهجا قائما على الخلايا العصبية للثدييات يمكن تكييفه والتلاعب به بسهولة باستخدام مصادر الخلايا وأنظمة الفحص المجهري المتاحة على نطاق واسع. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات المرضية (على سبيل المثال ، إيواء التعديلات المرتبطة بالمرض) لتحديد كيفية تأثير تعديلات معينة لهذه البروتينات على النقل في المحاور. وبالمثل ، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من بروتينات الشحن الموسومة بالفلورسنت لفحص التغيرات الخاصة بالبضائع. علاوة على ذلك ، تتم دراسة الآليات الجزيئية الأساسية بسهولة نسبية من خلال استهداف التعبير (أي الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير) للبروتينات المختارة التي قد تتوسط هذه التأثيرات. كما يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع الخلايا العصبية الأولية المشتقة من مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية.
نقدم بروتوكولا مفصلا يصف مقايسة نقل المحور العصبي للخلايا الحية التي كانت تستخدم سابقا في الخلايا العصبية الحصينية الأولية لإظهار أن بروتينات تاو الطافرة المرتبطة بالخرف الفصي الجبهي الصدغي (FTLD; P301L أو R5L tau) زيادة تردد التوقف المؤقت لبروتينات الشحن ذات العلامات الفلورية ثنائية الاتجاه12. علاوة على ذلك ، أنقذت ضربة قاضية من isoform PP1γ تأثيرات الإيقاف المؤقت12. يوفر هذا الدعم لنموذج الاضطراب المرضي الناجم عن تاو والذي يتم التوسط فيه من خلال التنشيط الشاذ لمسار الإشارات الذي بدأه PP1 كما هو موضح أعلاه6،7،12. في دراسة منفصلة ، أظهرنا أن الفسفرة الكاذبة للتاو عند S199 / S202 / T205 (الفوسفوبيتوب AT8 الممرض المرتبط باعتلال التاوباثي) زاد من تردد توقف البضائع وسرعة الجزء الأمامي. كانت هذه التأثيرات تعتمد على مجال تنشيط الفوسفاتيز N-terminal ل tau13. تسلط هذه الأمثلة الضوء على فائدة هذا النموذج في تحديد آليات كيفية تعطيل البروتينات المرضية لنقل المحور العصبي في الخلايا العصبية في الثدييات.
تقدم هذه الورقة وصفا تفصيليا للطريقة التي تبدأ بحصاد وتفكك وزراعة الخلايا العصبية الحصينية الأولية للفأر ، تليها نقل الخلايا العصبية مع بروتينات الشحن المدمجة مع بروتين الفلورسنت ، وأخيرا ، تصوير الخلايا الحية وتحليل الصور. نوضح كيف يتم استخدام هذه الطريقة لدراسة آثار تاو المعدل على النقل ثنائي الاتجاه للبروتين المرتبط بالحويصلة ، synaptophysin ، كمثال. ومع ذلك ، هناك مرونة في البروتين الممرض وبروتين نقل البضائع محل الاهتمام ، مما يجعل هذا نهجا متعدد الاستخدامات لدراسة النقل المحوري.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك أدلة متزايدة على أن البروتينات المرضية المتعددة المرتبطة بمجموعة متنوعة من الاضطرابات التنكسية العصبية تعطل النقل العصبي السريع في الخلايا العصبية. وهذا يمثل آلية مشتركة محتملة للسمية العصبية عبر هذه الأمراض. لفهم العملية التي تعطل بها هذه البروتينات النقل بشكل ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشيلسي تيرنان وكايل كريستنسن على جهودهما في تطوير وتحسين جوانب هذه البروتوكولات. تم دعم هذا العمل من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 NS082730 (N.M.K.) ، R01 AG044372 (n.m.k.) ، R01 AG067762 (N.M.K.) ، و F31 AG074521 (R.L.M.) ؛ المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للشيخوخة ، منحة مركز أبحاث مرض الزهايمر في ميشيغان 5P30AG053760 (N.M.K. و BC) ؛ مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال جائزة برنامج أبحاث الزهايمر الذي تمت مراجعته من قبل النظراء W81XWH-20-1-0174 (BC) ؛ منح أبحاث جمعية الزهايمر 20-682085 (قبل الميلاد) ؛ ومؤسسة عائلة سيكيا (N.M.K.).
Materials
| 0.4% Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | DOT | RN1700-GMT | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| 3 mL syringe with 21 G needle | Fisher | 14-826-84 | |
| 10 mL plastic syringe | Fisher | 14-823-2A | |
| 14 G needle | Fisher | 14-817-203 | |
| 15 G needle | Medline | SWD200029Z | |
| 16 G needle | Fisher | 14-817-104 | |
| 18 G needle | Fisher | 14-840-97 | |
| 22 G needle | Fisher | 14-840-90 | |
| 32% paraformaldehyde | Fisher | 50-980-495 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21244 | RRID:AB_2535813 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4" | Roboz | RS-5163 | autoclave |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Gibco | A3582801 | |
| BioCoat 24-well Poly D lysine plates | Fisher | 08-774-124 | |
| boric acid | Sigma | B6768-1KG | |
| Calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors | Roboz | RS-5658 | autoclave |
| Cell counting device | automatic or manual | ||
| Confocal microscope with live cell chamber attachment | |||
| Confocal imaging software | |||
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DNase I (Worthington) | Fisher | NC9185812 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200-075 | |
| EGTA | Fisher | O2783-100 | |
| Fatal-Plus Solution | Vortech Pharmaceuticals, LTD | NDC 0298-9373-68 | sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Gibco | 24020-117 | |
| ImageJ version 1.51n | ImageJ | Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| KymoAnalyzer (version 1.01) | Encalada Lab | Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | 100022050 | Use with P3000 transfection enhancer reagent |
| Magnesium chloride | Fisher | AC223211000 | |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | autoclave |
| Neurobasal Plus medium | Gibco | A3582901 | |
| Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a | UC Davis/NIH NeuroMab | 75-172 | RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons |
| Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG | Cell Signaling | 15034 | RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons |
| newborn calf serum | Gibco | 16010-167 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062 | |
| P3000 | Invitrogen | 100022057 | |
| Petri dish, 100 x 10 mm glass | Fisher | 08-748B | For dissection; autoclave |
| Petri dish, 100 x 20 mm glass | Fisher | 08-748D | To place uterine horns in; autoclave |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886-100MG | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Sodium acetate | Sigma | S5636 | |
| sodium borate decahydrate | VWR | MK745706 | |
| Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp | Fisher | 13-810-2 | autoclave |
| Syringe Filters, 0.22 µm | VWR | 514-1263 | |
| Thumb dressing forceps, serrated, 4.5" | Roboz | RS-8100 | autoclave |
| µ-Slide 4 Well Glass Bottom | Ibidi | 80427 |
References
- Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms. Front Neurosci. 11, 572 (2017).
- Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. Tau and axonal transport misregulation in tauopathies. Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).
- Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
- Morfini, G. A., et al. Axonal transport defects in neurodegenerative diseases. J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).
- Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon. Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).
- LaPointe, N. E., et al. The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity. J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).
- Kanaan, N. M., et al. Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases. J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).
- Kanaan, N. M., et al. Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport. Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).
- Pigino, G., et al. Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).
- Morfini, G. A., et al. Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin. Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).
- Morfini, G. A., et al. Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase. PLoS One. 8 (6), e65235 (2013).
- Combs, B., et al. Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism. J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).
- Christensen, K. R., et al. Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons. Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. (65), 3634 (2012).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Cox, K., et al. Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition. Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).
- Tiernan, C. T., et al. Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport. Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).
- Mueller, R. L., et al. Tau: a signaling hub protein. Front Mol Neurosci. 14, 647054 (2021).
- Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity. J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).
- Basu, H., Schwarz, T. L. QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance. Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108 (2020).
.