Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması
Summary
Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.
Abstract
Yüklerin akson boyunca çift yönlü taşınması, fonksiyonel sinapsları, nöral bağlantıyı ve sağlıklı nöronları korumak için kritik öneme sahiptir. Aksonal taşıma, çoklu nörodejeneratif hastalıklarda bozulur ve projeksiyon nöronları, hücresel materyalleri uzun mesafeler boyunca taşıma ve önemli aksonal kütleyi sürdürme ihtiyacı nedeniyle özellikle savunmasızdır. Tau, amiloid-β, α-sinüklein, süperoksit dismutaz ve huntingtin dahil olmak üzere hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerin patolojik modifikasyonları, patolojik proteinlerin hastalıkta toksisite uyguladığı potansiyel bir ortak mekanizma sağlayarak transportu olumsuz etkiler. Bu toksik mekanizmaları inceleme yöntemleri, nörodejeneratif bozuklukları anlamak ve potansiyel terapötik müdahaleleri belirlemek için gereklidir.
Burada, kültürlenmiş primer kemirgen hipokampal nöronları, floresan etiketli kargo proteinlerinin canlı hücre konfokal görüntülemesini kullanarak patolojik proteinlerin hızlı aksonal taşıma üzerindeki etkilerini incelemek için çoklu plazmitlerle birlikte transfekte edilir. Kemirgenlerden birincil hipokampal nöronların toplanması, ayrıştırılması ve kültürlenmesi ile başlıyoruz. Daha sonra, floresan etiketli kargo proteinini ve vahşi tip veya mutant tau’yu (patolojik proteinlerin bir örneği olarak kullanılır) eksprese etmek için nöronları plazmit DNA yapılarıyla birlikte transfekte ederiz. Aksonlar, canlı hücrelerde, hücre dışı bir nörofasin alanını, bir akson başlangıç segmenti proteinini bağlayan bir antikor kullanılarak tanımlanır ve floresan kargo taşınmasını ölçmek için ilgilenilen bir aksonal bölge görüntülenir.
Ücretsiz olarak kullanılabilen bir ImageJ makrosu olan KymoAnalyzer’ı kullanarak, tümü patolojik proteinlerin varlığından etkilenebilecek aksonal taşımanın hızını, duraklama frekansını ve yönlü kargo yoğunluğunu kapsamlı bir şekilde karakterize ediyoruz. Bu yöntem sayesinde, patolojik tau proteininin ekspresyonu ile ilişkili artmış kargo duraklama sıklığının bir fenotipini tanımlarız. Ek olarak, diğer proteinlerin taşıma bozulmasına aracılık etmedeki rolünü test etmek için transfeksiyon karışımına gen susturucu shRNA yapıları eklenebilir. Bu protokol, diğer nörodejeneratif hastalıkla ilişkili proteinlerle kullanım için kolayca uyarlanabilir ve bu proteinlerin aksonal taşımayı nasıl bozduğunun mekanizmalarını incelemek için tekrarlanabilir bir yöntemdir.
Introduction
Nöronlar, fonksiyonel sinapsları ve sinirsel bağlantıyı sürdürmek için akson boyunca yükün çift yönlü taşınmasına bağlıdır. Aksonal transport eksikliklerinin, Alzheimer hastalığı (AD) ve diğer tauopatiler, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz ve Huntington hastalığıdahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların patogenezine kritik katkıda bulunduğu düşünülmektedir 1,2,3. Gerçekten de, hastalıkla ilişkili çeşitli proteinlerdeki patolojik modifikasyonlar, taşımayı olumsuz yönde etkiler (4’te gözden geçirilmiştir). Patolojik proteinlerin hastalıkta toksisite uyguladığı mekanizmaları araştırmak için yöntemler geliştirmek, nörodejeneratif bozuklukları anlamak ve terapötik müdahale için potansiyel hedefleri belirlemek için gereklidir.
Konvansiyonel kinesinin keşfi, motor proteinleri düzenleyen kinaz ve fosfataz bağımlı yollar ve patolojik proteinlerin akson taşınmasının düzenlenmesini bozduğu mekanizmalar da dahil olmak üzere akson taşınmasına ilişkin birçok önemli bilgi, izole kalamar aksoplazma modeli 4,5 kullanılarak yapılmıştır. Kalamar aksoplazmasının tau proteininin patolojik formları ile perfüzyonu, protein fosfataz 1’i (PP1) aktive eden tau’nun fosfataz aktive edici alanının maruz kalmasına bağlı bir etki olan anterograd hızlı aksonal taşımayı (FAT) inhibe eder6,7,8. PP1, glikojen sentaz kinaz 3’ü (GSK3) aktive eder, bu da kinesin hafif zincirlerini fosforile ederek kargonun salınmasına neden olur. AD’deki bir diğer patolojik protein amiloid-β’dir. Amiloid-β’in oligomerik formları, kinesin hafif zincirlerini9 fosforile eden kazein kinaz 2 yoluyla çift yönlü FAT’ı inhibe eder. Ayrıca, bir poliglutamin genişlemesi ve ailesel ALS’ye bağlı bir SOD1 mutantı barındıran patolojik huntingtin proteininin her biri, sırasıyla c-Jun N-terminal kinaz ve p38 mitojenle aktive olan protein kinaz aktivitesi yoluyla kalamar aksoplazmasında aksonal taşımayı bozar10,11.
Kalamar aksoplazma modeli, patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini anlamada değerli bir araç olmaya devam ederken, ekipmana ve örneklere sınırlı erişim, daha yaygın olarak kullanılmasını engellemektedir. Kemirgen (fare ve sıçan) primer nöronlarının canlı hücre konfokal mikroskopi görüntülemesini kullanarak bir taşıma testi geliştirdik. Bu model, yaygın olarak bulunan hücre kaynakları ve mikroskopi sistemleri kullanılarak kolayca uyarlanabilir ve manipüle edilebilir memeli nöron tabanlı bir yaklaşımı temsil eder. Örneğin, bu proteinlerin spesifik modifikasyonlarının aksonlarda taşınmayı nasıl etkilediğini belirlemek için çeşitli patolojik proteinler (örneğin, hastalıkla ilgili modifikasyonları barındıran) ifade edilir. Benzer şekilde, kargoya özgü değişiklikleri incelemek için çeşitli floresan etiketli kargo proteinleri kullanılabilir. Ayrıca, altta yatan moleküler mekanizmalar, bu etkilere aracılık edebilecek seçilmiş proteinlerin ekspresyonunu (yani, knockdown veya aşırı ekspresyon) hedefleyerek nispeten kolay bir şekilde incelenir. Bu yöntem aynı zamanda çok çeşitli hayvan modellerinden türetilen birincil nöronlar için kolayca uyarlanabilir.
Frontotemporal lober demanslarla ilişkili mutant tau proteinlerinin (FTLD; P301L veya R5L tau), floresan etiketli kargo proteinlerinin duraklama frekansını çift yönlü olarakartırın 12. Ayrıca, PP1γ izoformunun yıkılması, duraklatma etkilerini12 kurtardı. Bu, yukarıda 6,7,12 tarif edildiği gibi PP1 tarafından başlatılan bir sinyal yolunun anormal aktivasyonu yoluyla aracılık edilen patolojik tau kaynaklı bozulma modeli için destek sağlar. Ayrı bir çalışmada, tau’nun S199 / S202 / T205’te (taupatilerle ilgili patojenik AT8 fosfoepitopu) psödofosforilasyonunun kargo duraklama sıklığını ve anterograd segment hızını arttırdığını gösterdik. Bu etkiler, tau13’ün N-terminal fosfataz aktive edici alanına bağlıydı. Bu örnekler, patolojik proteinlerin memeli nöronlarında akson taşınmasını nasıl bozduğunun mekanizmalarını belirlemek için bu modelin faydasını vurgulamaktadır.
Bu makale, birincil fare hipokampal nöronlarının toplanması, ayrıştırılması ve kültürlenmesi ile başlayan, ardından nöronların bir floresan proteini ile kaynaşmış kargo proteinleri ile transfeksiyonu ve son olarak canlı hücre görüntüleme ve görüntü analizi yaklaşımının ayrıntılı bir tanımını sunmaktadır. Örnek olarak, modifiye tau’nun vezikülle ilişkili protein olan sinaptofizinin çift yönlü taşınması üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemin nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. Bununla birlikte, ilgilenilen patojenik protein ve taşıma kargo proteininde esneklik vardır, bu da bunu aksonal taşımayı incelemek için çok yönlü bir yaklaşım haline getirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili çoklu patolojik proteinlerin nöronlarda hızlı aksonal transportu bozduğuna dair artan kanıtlar vardır. Bu, bu hastalıklar arasında potansiyel bir ortak nörotoksisite mekanizmasını temsil eder. Bu proteinlerin taşımayı bozma sürecini daha iyi anlamak için, belirli soruları ele almamıza izin veren araçlara ve modellere ihtiyacımız var. Burada tarif edilen yöntem, kemirgenlerden primer hipokampal nöronlarda kargo ta?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chelsea Tiernan ve Kyle Christensen’e bu protokollerin özelliklerini geliştirme ve optimize etme çabaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri R01 NS082730 (NMK), R01 AG044372 (NMK), R01 AG067762 (NMK) ve F31 AG074521 (RPM); NIH/Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Michigan Alzheimer Hastalığı Araştırma Merkezi Hibe 5P30AG053760 (N.M.K. ve B.C.); Hakemli Alzheimer Araştırma Programı Ödülü W81XWH-20-1-0174 (BC) aracılığıyla Sağlık İşlerinden Sorumlu Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi; Alzheimer Derneği Araştırma Hibeleri 20-682085 (B.C.); ve Secchia Aile Vakfı (N.M.K.).
Materials
| 0.4% Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | DOT | RN1700-GMT | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| 3 mL syringe with 21 G needle | Fisher | 14-826-84 | |
| 10 mL plastic syringe | Fisher | 14-823-2A | |
| 14 G needle | Fisher | 14-817-203 | |
| 15 G needle | Medline | SWD200029Z | |
| 16 G needle | Fisher | 14-817-104 | |
| 18 G needle | Fisher | 14-840-97 | |
| 22 G needle | Fisher | 14-840-90 | |
| 32% paraformaldehyde | Fisher | 50-980-495 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21244 | RRID:AB_2535813 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4" | Roboz | RS-5163 | autoclave |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Gibco | A3582801 | |
| BioCoat 24-well Poly D lysine plates | Fisher | 08-774-124 | |
| boric acid | Sigma | B6768-1KG | |
| Calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors | Roboz | RS-5658 | autoclave |
| Cell counting device | automatic or manual | ||
| Confocal microscope with live cell chamber attachment | |||
| Confocal imaging software | |||
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DNase I (Worthington) | Fisher | NC9185812 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200-075 | |
| EGTA | Fisher | O2783-100 | |
| Fatal-Plus Solution | Vortech Pharmaceuticals, LTD | NDC 0298-9373-68 | sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Gibco | 24020-117 | |
| ImageJ version 1.51n | ImageJ | Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| KymoAnalyzer (version 1.01) | Encalada Lab | Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | 100022050 | Use with P3000 transfection enhancer reagent |
| Magnesium chloride | Fisher | AC223211000 | |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | autoclave |
| Neurobasal Plus medium | Gibco | A3582901 | |
| Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a | UC Davis/NIH NeuroMab | 75-172 | RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons |
| Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG | Cell Signaling | 15034 | RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons |
| newborn calf serum | Gibco | 16010-167 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062 | |
| P3000 | Invitrogen | 100022057 | |
| Petri dish, 100 x 10 mm glass | Fisher | 08-748B | For dissection; autoclave |
| Petri dish, 100 x 20 mm glass | Fisher | 08-748D | To place uterine horns in; autoclave |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886-100MG | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Sodium acetate | Sigma | S5636 | |
| sodium borate decahydrate | VWR | MK745706 | |
| Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp | Fisher | 13-810-2 | autoclave |
| Syringe Filters, 0.22 µm | VWR | 514-1263 | |
| Thumb dressing forceps, serrated, 4.5" | Roboz | RS-8100 | autoclave |
| µ-Slide 4 Well Glass Bottom | Ibidi | 80427 |
References
- Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms. Front Neurosci. 11, 572 (2017).
- Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. Tau and axonal transport misregulation in tauopathies. Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).
- Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
- Morfini, G. A., et al. Axonal transport defects in neurodegenerative diseases. J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).
- Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon. Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).
- LaPointe, N. E., et al. The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity. J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).
- Kanaan, N. M., et al. Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases. J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).
- Kanaan, N. M., et al. Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport. Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).
- Pigino, G., et al. Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).
- Morfini, G. A., et al. Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin. Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).
- Morfini, G. A., et al. Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase. PLoS One. 8 (6), e65235 (2013).
- Combs, B., et al. Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism. J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).
- Christensen, K. R., et al. Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons. Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. (65), 3634 (2012).
- Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
- Cox, K., et al. Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition. Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).
- Tiernan, C. T., et al. Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport. Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).
- Mueller, R. L., et al. Tau: a signaling hub protein. Front Mol Neurosci. 14, 647054 (2021).
- Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity. J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).
- Basu, H., Schwarz, T. L. QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance. Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108 (2020).
.