生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する
Summary
ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。
Abstract
軸索に沿った貨物の双方向輸送は、機能的なシナプス、神経接続、および健康なニューロンを維持するために重要です。軸索輸送は複数の神経変性疾患で中断され、投射ニューロンは、細胞材料を長距離輸送し、かなりの軸索質量を維持する必要があるため、特に脆弱です。タウ、アミロイドβ、α-シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ、ハンチンチンなど、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼし、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮する可能性のある共通のメカニズムを提供します。これらの毒性メカニズムを研究する方法は、神経変性疾患を理解し、潜在的な治療介入を特定するために必要です。
ここでは、培養した初代げっ歯類の海馬ニューロンを複数のプラスミドと同時トランスフェクトし、蛍光タグ付きカーゴタンパク質の生細胞共焦点イメージングを使用して、病理学的タンパク質が高速軸索輸送に及ぼす影響を研究します。私たちは、げっ歯類からの初代海馬ニューロンの採取、解離、および培養から始めます。次に、ニューロンにプラスミドDNAコンストラクトを共トランスフェクションして、蛍光タグ付きカーゴタンパク質と野生型または変異型のタウ(病理学的タンパク質の例として使用)を発現させます。軸索は、ニューロファシンの細胞外ドメインである軸索初期セグメントタンパク質に結合する抗体を使用して生細胞で同定され、関心のある軸索領域を画像化して蛍光カーゴ輸送を測定します。
無料で入手できるImageJマクロであるKymoAnalyzerを使用して、病理学的タンパク質の存在によって影響を受ける可能性のある軸索輸送の速度、一時停止頻度、および指向性貨物密度を広範囲に特徴付けます。この方法により、病理学的タウタンパク質の発現に関連するカーゴ一時停止頻度の増加の表現型を特定します。さらに、遺伝子サイレンシングshRNAコンストラクトをトランスフェクションミックスに添加して、輸送妨害の媒介における他のタンパク質の役割を試験することができます。このプロトコルは、他の神経変性疾患関連タンパク質との使用に容易に適応でき、これらのタンパク質が軸索輸送をどのように妨害するかのメカニズムを研究するための再現性のある方法です。
Introduction
ニューロンは、機能的なシナプスと神経接続を維持するために、軸索に沿った貨物の双方向輸送に依存しています。軸索輸送障害は、アルツハイマー病(AD)やその他のタウオパチー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病など、いくつかの神経変性疾患の病因に重大な貢献をしていると考えられています1,2,3。実際、いくつかの疾患関連タンパク質の病理学的修飾は輸送に悪影響を及ぼします(4)でレビュー。神経変性疾患を理解し、治療介入の潜在的な標的を特定するためには、病理学的タンパク質が疾患において毒性を発揮するメカニズムを調査する方法を開発する必要があります。
従来のキネシンの発見、運動タンパク質を調節するキナーゼおよびホスファターゼ依存性経路、病理学的タンパク質が軸索輸送の調節を妨害するメカニズムなど、軸索輸送に関するいくつかの重要な洞察が、単離されたイカ軸索形質モデル4,5を用いてなされた。イカの軸索形質と病理学的形態のタウタンパク質との灌流は、前向性高速軸索輸送(FAT)を阻害し、この効果はタウのホスファターゼ活性化ドメインの曝露に依存し、タンパク質ホスファターゼ1(PP1)を活性化します6,7,8。PP1はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3(GSK3)を活性化し、GSK3はキネシン軽鎖をリン酸化してカーゴの放出を引き起こします。ADの別の病理学的タンパク質はアミロイドβです。オリゴマー型のアミロイドβは、カゼインキナーゼ2を介して双方向のFATを阻害し、カゼインキナーゼ2はキネシン軽鎖をリン酸化します9。さらに、ポリグルタミン増殖を有する病理学的ハンチンチンタンパク質と家族性ALS関連SOD1変異体は、それぞれc-Jun N末端キナーゼおよびp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性を介してイカ軸索プラズム内の軸索輸送を妨害する10,11。
イカ軸索プラズムモデルは、病理学的タンパク質が軸索輸送に及ぼす影響を理解するための貴重なツールであり続けていますが、装置や標本へのアクセスが限られているため、より広く使用されることがありません。私たちは、げっ歯類(マウスおよびラット)の初代ニューロンの生細胞共焦点顕微鏡イメージングを使用して輸送アッセイを開発しました。このモデルは、広く利用可能な細胞源と顕微鏡システムを使用した、容易に適応可能で操作可能な哺乳類ニューロンベースのアプローチを表しています。例えば、さまざまな病理学的タンパク質(例えば、疾患関連修飾を有する)を発現させ、これらのタンパク質の特異的修飾が軸索の輸送にどのように影響するかを同定します。同様に、さまざまな蛍光標識カーゴタンパク質を使用して、カーゴ特異的な変化を調べることができます。さらに、これらの効果を媒介する可能性のある選択されたタンパク質の発現(すなわち、ノックダウンまたは過剰発現)を標的とすることにより、基礎となる分子メカニズムを比較的容易に研究できます。この方法は、さまざまな動物モデルに由来する初代ニューロンにも容易に適応できます。
私たちは、以前に初代海馬ニューロンで使用されていた生細胞軸索輸送アッセイを説明する詳細なプロトコルを提示し、変異タウタンパク質が前頭側頭葉性認知症(FTLD;P301LまたはR5Lタウ)は、蛍光標識されたカーゴタンパク質の一時停止頻度を双方向に増加させる12。さらに、PP1γアイソフォームのノックダウンは、一時停止効果12を救った。これは、上記のようにPP1によって開始されるシグナル伝達経路の異常な活性化を通じて媒介される病理学的タウ誘発性破壊のモデルを支持する6,7,12を提供する。別の研究では、S199/S202/T205(タウオパチーに関連する病原性AT8ホスホエピトープ)でのタウの偽リン酸化が、貨物の一時停止頻度と前向性セグメントの速度を増加させることを示しました。これらの影響は、タウ13のN末端ホスファターゼ活性化ドメインに依存していました。これらの例は、病理学的タンパク質が哺乳類ニューロンの軸索輸送をどのように妨害するかのメカニズムを特定するためのこのモデルの有用性を強調しています。
この論文では、初代マウス海馬ニューロンの採取、解離、培養から始まり、蛍光タンパク質と融合したカーゴタンパク質によるニューロンのトランスフェクション、そして最後に生細胞イメージングと画像解析のアプローチについて詳しく説明します。例として、この方法を使用して、小胞関連タンパク質であるシナプトフィジンの双方向輸送に対する修飾タウの影響を研究する方法を示します。ただし、目的の病原性タンパク質と輸送貨物タンパク質には柔軟性があるため、これは軸索輸送を研究するための汎用性の高いアプローチになります。
Protocol
Representative Results
Discussion
さまざまな神経変性疾患に関連する複数の病理学的タンパク質が、ニューロンの高速軸索輸送を妨害するという証拠が増えています。これは、これらの疾患に共通する神経毒性のメカニズムである可能性を表しています。これらのタンパク質が輸送を妨害するプロセスをよりよく理解するには、特定の問題に対処できるツールとモデルが必要です。ここで説明する方…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらのプロトコルの側面の開発と最適化に尽力してくれたChelsea TiernanとKyle Christensenに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01 NS082730(N.M.K.)、R01 AG044372(N.M.K.)、R01 AG067762(N.M.K.)、およびF31 AG074521(R.L.M.)によって支援されました。NIH/National Institute on Aging, Michigan Alzheimer’s Disease Research Center Grant 5P30AG053760 (N.M.K. and B.C.);保健問題担当国防次官補室は、査読付きアルツハイマー病研究プログラム賞W81XWH-20-1-0174(BC)を通じて。アルツハイマー病協会研究助成金20-682085(BC);セッキアファミリー財団(NMK)。
Materials
| 0.4% Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | DOT | RN1700-GMT | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| 3 mL syringe with 21 G needle | Fisher | 14-826-84 | |
| 10 mL plastic syringe | Fisher | 14-823-2A | |
| 14 G needle | Fisher | 14-817-203 | |
| 15 G needle | Medline | SWD200029Z | |
| 16 G needle | Fisher | 14-817-104 | |
| 18 G needle | Fisher | 14-840-97 | |
| 22 G needle | Fisher | 14-840-90 | |
| 32% paraformaldehyde | Fisher | 50-980-495 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21244 | RRID:AB_2535813 |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4" | Roboz | RS-5163 | autoclave |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Gibco | A3582801 | |
| BioCoat 24-well Poly D lysine plates | Fisher | 08-774-124 | |
| boric acid | Sigma | B6768-1KG | |
| Calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors | Roboz | RS-5658 | autoclave |
| Cell counting device | automatic or manual | ||
| Confocal microscope with live cell chamber attachment | |||
| Confocal imaging software | |||
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DNase I (Worthington) | Fisher | NC9185812 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200-075 | |
| EGTA | Fisher | O2783-100 | |
| Fatal-Plus Solution | Vortech Pharmaceuticals, LTD | NDC 0298-9373-68 | sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | glutamine substitute |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Gibco | 24020-117 | |
| ImageJ version 1.51n | ImageJ | Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| KymoAnalyzer (version 1.01) | Encalada Lab | Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | 100022050 | Use with P3000 transfection enhancer reagent |
| Magnesium chloride | Fisher | AC223211000 | |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | autoclave |
| Neurobasal Plus medium | Gibco | A3582901 | |
| Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a | UC Davis/NIH NeuroMab | 75-172 | RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons |
| Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG | Cell Signaling | 15034 | RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons |
| newborn calf serum | Gibco | 16010-167 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-062 | |
| P3000 | Invitrogen | 100022057 | |
| Petri dish, 100 x 10 mm glass | Fisher | 08-748B | For dissection; autoclave |
| Petri dish, 100 x 20 mm glass | Fisher | 08-748D | To place uterine horns in; autoclave |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7886-100MG | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher | 14-955-238 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Sodium acetate | Sigma | S5636 | |
| sodium borate decahydrate | VWR | MK745706 | |
| Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp | Fisher | 13-810-2 | autoclave |
| Syringe Filters, 0.22 µm | VWR | 514-1263 | |
| Thumb dressing forceps, serrated, 4.5" | Roboz | RS-8100 | autoclave |
| µ-Slide 4 Well Glass Bottom | Ibidi | 80427 |
References
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