Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Neuronen zijn afhankelijk van het bidirectionele transport van vracht langs het axon om functionele synapsen en neurale connectiviteit te behouden. Axonale transporttekorten worden verondersteld een cruciale bijdrage te leveren aan de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD) en andere tauopathieën, de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose en de ziekte van Huntington ^1,2,3. Pathologische modificaties van verschillende ziektegerelateerde eiwitten hebben inderdaad een negatieve invloed op het transport (besproken in ⁴). Het ontwikkelen van methoden om de mechanismen te onderzoeken waarmee pathologische eiwitten toxiciteit uitoefenen bij ziekte is noodzakelijk om neurodegeneratieve aandoeningen te begrijpen en potentiële doelen voor therapeutische interventie te identificeren.

Verschillende belangrijke inzichten in axontransport, waaronder de ontdekking van conventioneel kinesine, de kinase- en fosfatase-afhankelijke routes die motoreiwitten reguleren, en mechanismen waarmee pathologische eiwitten de regulatie van axontransport verstoren, werden gedaan met behulp van het geïsoleerde inktvisaxofasmemodel ^4,5. Perfusie van inktvisaxofosma met pathologische vormen van tau-eiwit remt anterograde snel axonaal transport (FAT), een effect dat afhankelijk is van de blootstelling van het fosfatase-activerende domein van tau, dat eiwitfosfatase 1 (PP1) activeert6,7,8. PP1 activeert glycogeensynthasekinase 3 (GSK3), dat op zijn beurt kinesine lichte ketens fosforyleert, waardoor lading vrijkomt. Een ander pathologisch eiwit bij AD is amyloïde-β. Oligomere vormen van amyloïde-β remmen bidirectioneel FAT door caseïnekinase 2, dat kinesine lichte ketens fosforyleert⁹. Bovendien verstoort pathologisch huntingtine-eiwit met een polyglutamine-expansie en een familiale ALS-gekoppelde SOD1-mutant elk het axonale transport in het inktvisaxofosma via c-Jun N-terminaal kinase en p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-activiteit, respectievelijk^10,11.

Hoewel het inktvisaxofasma-model een waardevol hulpmiddel blijft bij het begrijpen van de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport, voorkomt beperkte toegang tot de apparatuur en monsters dat het op grotere schaal wordt gebruikt. We ontwikkelden een transporttest met behulp van confocale microscopiebeeldvorming met levende cellen van primaire neuronen van knaagdieren (muizen en ratten). Dit model vertegenwoordigt een gemakkelijk aanpasbare en manipuleerbare op zoogdierneuronen gebaseerde benadering met behulp van algemeen beschikbare celbronnen en microscopiesystemen. Bijvoorbeeld, een verscheidenheid aan pathologische eiwitten (bijv. die ziektegerelateerde modificaties herbergen) worden tot expressie gebracht om te identificeren hoe specifieke modificaties van deze eiwitten het transport in axonen beïnvloeden. Op dezelfde manier kan een verscheidenheid aan fluorescerend gelabelde ladingeiwitten worden gebruikt om ladingspecifieke veranderingen te onderzoeken. Bovendien kunnen de onderliggende moleculaire mechanismen relatief eenvoudig worden bestudeerd door zich te richten op expressie (d.w.z. knockdown of overexpressie) van geselecteerde eiwitten die deze effecten kunnen mediëren. Deze methode is ook gemakkelijk aan te passen voor primaire neuronen die zijn afgeleid van een grote verscheidenheid aan diermodellen.

We presenteren een gedetailleerd protocol dat de live-cell axontransporttest beschrijft die eerder werd gebruikt in primaire hippocampale neuronen om aan te tonen dat mutante tau-eiwitten geassocieerd met frontotemporale kwabdementie (FTLD; P301L of R5L tau) verhogen de pauzefrequentie van fluorescerend gelabelde ladingeiwitten bidirectioneel¹². Bovendien heeft de knockdown van de PP1γ-isovorm de pauze-effecten gered¹². Dit biedt ondersteuning voor het model van pathologische tau-geïnduceerde verstoring dat wordt gemedieerd door afwijkende activering van een signaalroute geïnitieerd door PP1 zoals hierboven beschreven ^6,7,12. In een afzonderlijke studie toonden we aan dat pseudofosforylering van tau bij S199/S202/T205 (het pathogene AT8-fosfoepitoop dat relevant is voor tauopathieën) de frequentie van de ladingpauze en de snelheid van het anterograde segment verhoogde. Deze effecten waren afhankelijk van het N-terminale fosfatase-activerende domein van tau¹³. Deze voorbeelden benadrukken het nut van dit model voor het identificeren van de mechanismen van hoe pathologische eiwitten het axontransport in zoogdierneuronen verstoren.

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van de methode die begint met het oogsten, dissociëren en kweken van primaire hippocampusneuronen van muizen, gevolgd door de transfectie van de neuronen met vrachteiwitten gefuseerd met een fluorescerend eiwit, en ten slotte de benadering van live-cell beeldvorming en beeldanalyse. We laten zien hoe deze methode wordt gebruikt om de effecten van gemodificeerd tau op het bidirectionele transport van het blaasjes-geassocieerde eiwit, synaptofysine, te bestuderen. Er is echter flexibiliteit in het pathogene eiwit en het transportladingseiwit van belang, waardoor dit een veelzijdige benadering is om axonaal transport te bestuderen.