Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Les neurones dépendent du transport bidirectionnel de la cargaison le long de l’axone pour maintenir les synapses fonctionnelles et la connectivité neuronale. On pense que les déficits de transport axonal contribuent de manière essentielle à la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA) et d’autres tauopathies, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington ^1,2,3. En effet, les modifications pathologiques de plusieurs protéines liées à la maladie affectent négativement le transport (examiné dans ⁴). Il est nécessaire de développer des méthodes pour étudier les mécanismes par lesquels les protéines pathologiques exercent une toxicité dans la maladie afin de comprendre les troubles neurodégénératifs et d’identifier des cibles potentielles pour une intervention thérapeutique.

Plusieurs connaissances importantes sur le transport axonal, y compris la découverte de la kinésine conventionnelle, des voies dépendantes de la kinase et de la phosphatase régulant les protéines motrices, et des mécanismes par lesquels les protéines pathologiques perturbent la régulation du transport axonal, ont été réalisées à l’aide du modèle isolé de l’axoplasme de calmar ^4,5. La perfusion de l’axoplasme du calmar avec des formes pathologiques de la protéine tau inhibe le transport axonal rapide antérograde (FAT), un effet dépendant de l’exposition au domaine activateur de la phosphatase de tau, qui active la protéine phosphatase 1 (PP1)^6,7,8. PP1 active la glycogène synthase kinase 3 (GSK3), qui à son tour phosphoryle les chaînes légères de kinésine, provoquant la libération de cargaison. Une autre protéine pathologique de la MA est la β amyloïde. Les formes oligomères de β amyloïde inhibent la FAT bidirectionnelle par l’intermédiaire de la caséine kinase 2, qui phosphoryle les chaînes légères de kinésine⁹. De plus, la protéine huntingtine pathologique hébergeant une expansion de la polyglutamine et un mutant SOD1 familial lié à la SLA perturbent chacun le transport axonal dans l’axoplasme du calmar par l’activité de la protéine kinase N-terminale c-Jun et de la protéine kinase activée par les mitogènes p38, respectivement^10,11.

Bien que le modèle de l’axoplasme du calmar continue d’être un outil précieux pour comprendre les effets des protéines pathologiques sur le transport axonal, l’accès limité à l’équipement et aux échantillons empêche son utilisation plus large. Nous avons mis au point un test de transport utilisant l’imagerie par microscopie confocale de cellules vivantes de neurones primaires de rongeurs (souris et rats). Ce modèle représente une approche basée sur les neurones de mammifères, facilement adaptable et manipulable, utilisant des sources cellulaires et des systèmes de microscopie largement disponibles. Par exemple, une variété de protéines pathologiques (par exemple, hébergeant des modifications liées à la maladie) sont exprimées pour identifier comment des modifications spécifiques de ces protéines affectent le transport dans les axones. De même, une variété de protéines cargo marquées par fluorescence peuvent être utilisées pour examiner les changements spécifiques à la cargaison. De plus, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont étudiés relativement facilement en ciblant l’expression (c’est-à-dire l’inactivation ou la surexpression) de protéines sélectionnées qui peuvent médier ces effets. Cette méthode est également facilement adaptable pour les neurones primaires dérivés d’une grande variété de modèles animaux.

Nous présentons un protocole détaillé décrivant le test de transport axonal de cellules vivantes qui a été précédemment utilisé dans les neurones primaires de l’hippocampe pour montrer que les protéines tau mutantes associées aux démences lobaires frontotemporales ; P301L ou R5L tau) augmentent la fréquence de pause des protéines cargo marquées par fluorescence de manière bidirectionnelle¹². De plus, le renversement de l’isoforme PP1γ a sauvé les effets de pause¹². Cela fournit un soutien au modèle de perturbation pathologique induite par la protéine tau qui est médiée par l’activation aberrante d’une voie de signalisation initiée par PP1 comme décrit ci-dessus ^6,7,12. Dans une étude distincte, nous avons montré que la pseudophosphorylation de tau à S199/S202/T205 (le phosphoépitope pathogène AT8 pertinent pour les tauopathies) augmentait la fréquence des pauses de cargaison et la vitesse du segment antérograde. Ces effets dépendaient du domaine d’activation de la phosphatase N-terminale de tau¹³. Ces exemples soulignent l’utilité de ce modèle pour identifier les mécanismes par lesquels les protéines pathologiques perturbent le transport des axones dans les neurones des mammifères.

Cet article fournit une description détaillée de la méthode commençant par la récolte, la dissociation et la culture des neurones primaires de l’hippocampe de souris, suivie de la transfection des neurones avec des protéines cargo fusionnées avec une protéine fluorescente, et enfin, de l’approche d’imagerie et d’analyse d’images de cellules vivantes. Nous démontrons comment cette méthode est utilisée pour étudier les effets de la protéine tau modifiée sur le transport bidirectionnel de la protéine associée à la vésicule, la synaptophysine, à titre d’exemple. Cependant, il existe une flexibilité dans la protéine pathogène et la protéine de transport d’intérêt, ce qui en fait une approche polyvalente pour étudier le transport axonal.