שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

תאי עצב תלויים בהובלה דו-כיוונית של מטען לאורך האקסון כדי לשמור על סינפסות תפקודיות וקישוריות עצבית. ליקויים בהובלה אקסונלית נחשבים לתורמים קריטיים לפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות, כולל מחלת אלצהיימר (AD) וטאואופתים אחרים, מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית ומחלת הנטינגטון ^1,2,3. ואכן, שינויים פתולוגיים במספר חלבונים הקשורים למחלות משפיעים לרעה על התחבורה (נסקר ב ^-4). פיתוח שיטות לחקר המנגנונים שבאמצעותם חלבונים פתולוגיים מפעילים רעילות במחלות נחוץ כדי להבין הפרעות נוירודגנרטיביות ולזהות מטרות פוטנציאליות להתערבות טיפולית.

מספר תובנות חשובות על העברת אקסונים, כולל גילוי קינזין קונבנציונלי, מסלולים תלויי קינאז ופוספטאז המווסתים חלבונים מוטוריים, ומנגנונים שבאמצעותם חלבונים פתולוגיים משבשים את ויסות העברת האקסונים, נעשו באמצעות מודל אקסופלזמה של דיונון מבודד ^4,5. זילוח של אקסופלסמת דיונון עם צורות פתולוגיות של חלבון טאו מעכב הובלה אקסונלית מהירה אנטרוגרדית (FAT), השפעה התלויה בחשיפה של תחום הפעלת פוספטאז של טאו, אשר מפעיל את חלבון phosphatase 1 (PP1)^6,7,8. PP1 מפעיל גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3), אשר בתורו פוספורילטים קינזין שרשראות אור גורם לשחרור מטען. חלבון פתולוגי נוסף באלצהיימר הוא עמילואיד-β. צורות אוליגומריות של β עמילואיד מעכבות FAT דו-כיווני באמצעות קזאין קינאז 2, אשר פוספורילטים קינזין שרשראות אור⁹. יתר על כן, חלבון הנטינגטין פתולוגי בעל הרחבת פוליגלוטמין ומוטציה משפחתית SOD1 הקשורה ל-ALS משבשים כל אחד את ההובלה האקסונלית באקסופלזמה של דיונון דרך פעילות קינאז c-Jun N-terminal וחלבון קינאז p38 המופעל על ידי מיטוגן, בהתאמה^10,11.

בעוד מודל אקסופלזמה דיונון ממשיך להיות כלי רב ערך בהבנת ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית, גישה מוגבלת לציוד ולדגימות מונעת ממנו להיות בשימוש נרחב יותר. פיתחנו בדיקת הובלה באמצעות הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של תאים חיים של נוירונים ראשוניים של מכרסמים (עכבר וחולדה). מודל זה מייצג גישה מבוססת תאי עצב של יונקים הניתנת להתאמה ולמניפולציה בקלות באמצעות מקורות תאים זמינים באופן נרחב ומערכות מיקרוסקופיה. לדוגמה, מגוון חלבונים פתולוגיים (למשל, בעלי שינויים הקשורים למחלות) באים לידי ביטוי כדי לזהות כיצד שינויים ספציפיים של חלבונים אלה משפיעים על ההובלה באקסונים. באופן דומה, ניתן להשתמש במגוון חלבוני מטען בעלי תיוג פלואורסצנטי כדי לבחון שינויים ספציפיים למטען. יתר על כן, המנגנונים המולקולריים הבסיסיים נחקרים בקלות יחסית על ידי מיקוד ביטוי (כלומר, הפלה או ביטוי יתר) של חלבונים נבחרים שעשויים לתווך השפעות אלה. שיטה זו גם מותאמת בקלות לתאי עצב ראשוניים שמקורם במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את בדיקת העברת האקסון החי ששימש בעבר בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס כדי להראות כי חלבוני טאו מוטנטיים הקשורים לדמנציה של האונה הקדמית (FTLD; P301L או R5L tau) מגבירים את תדירות ההשהיה של חלבוני מטען בעלי תווית פלואורסצנטית דו-כיוונית¹². יתר על כן, הפלת האיזופורם PP1γ הצילה את השפעות ההשהיה¹². זה מספק תמיכה למודל של הפרעה פתולוגית הנגרמת על ידי טאו המתווכת באמצעות הפעלה חריגה של מסלול איתות ביוזמת PP1 כמתואר לעיל ^6,7,12. במחקר נפרד, הראינו כי פסאודו-פוספורילציה של טאו ב-S199/S202/T205 (הפוספואפיטופ AT8 הפתוגני הרלוונטי לטאופתיות) הגבירה את תדירות השהיית המטען ואת מהירות המקטע האנטרוגרד. השפעות אלה היו תלויות בתחום הפעלת הפוספטאז N-terminal של טאו¹³. דוגמאות אלה מדגישות את התועלת של מודל זה לזיהוי המנגנונים של האופן שבו חלבונים פתולוגיים משבשים את העברת האקסון בנוירונים של יונקים.

מאמר זה מספק תיאור מפורט של השיטה המתחילה בקציר, דיסוציאציה וטיפוח של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של עכברים, לאחר מכן טרנספקציה של תאי עצב עם חלבוני מטען המאוחים עם חלבון פלואורסצנטי, ולבסוף, גישת הדמיה וניתוח תמונה של תאים חיים. אנו מדגימים כיצד שיטה זו משמשת לחקר ההשפעות של טאו שונה על ההובלה הדו-כיוונית של החלבון הקשור לשלפוחית, סינפטופיזין, כדוגמה. עם זאת, קיימת גמישות בחלבון הפתוגני ובחלבון המטען התובלה, מה שהופך את זה לגישה רב-תכליתית לחקר הובלה אקסונלית.