Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Las neuronas dependen del transporte bidireccional de carga a lo largo del axón para mantener las sinapsis funcionales y la conectividad neuronal. Se cree que los déficits de transporte axonal contribuyen de manera crítica a la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y otras tauopatías, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Huntington ^1,2,3. De hecho, las modificaciones patológicas de varias proteínas relacionadas con la enfermedad afectan negativamente al transporte (revisado en ⁴). El desarrollo de métodos para investigar los mecanismos por los cuales las proteínas patológicas ejercen toxicidad en la enfermedad es necesario para comprender los trastornos neurodegenerativos e identificar posibles objetivos para la intervención terapéutica.

Varias ideas importantes sobre el transporte de axones, incluido el descubrimiento de la kinesina convencional, las vías dependientes de quinasa y fosfatasa que regulan las proteínas motoras, y los mecanismos por los cuales las proteínas patológicas interrumpen la regulación del transporte de axones, se realizaron utilizando el modelo de axoplasma de calamar aislado ^4,5. La perfusión de axoplasma de calamar con formas patológicas de proteína tau inhibe el transporte axonal rápido anterógrado (FAT), un efecto dependiente de la exposición del dominio activador de la fosfatasa de tau, que activa la proteína fosfatasa 1 (PP1)^6,7,8. PP1 activa la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), que a su vez fosforila las cadenas ligeras de quinesina causando la liberación de la carga. Otra proteína patológica en la EA es la β amiloide. Las formas oligoméricas de β amiloide inhiben la grasa bidireccional a través de la caseína quinasa 2, que fosforila las cadenas ligeras de quinesina⁹. Además, la proteína huntingtina patológica que alberga una expansión de poliglutamina y un mutante SOD1 familiar ligado a la ELA interrumpen el transporte axonal en el axoplasma del calamar a través de la quinasa N-terminal c-Jun y la actividad de la proteína quinasa activada por mitógenos p38, respectivamente^10,11.

Si bien el modelo de axoplasma de calamar sigue siendo una herramienta valiosa para comprender los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal, el acceso limitado al equipo y a las muestras impide que se utilice más ampliamente. Desarrollamos un ensayo de transporte utilizando imágenes de microscopía confocal de células vivas de neuronas primarias de roedores (ratones y ratas). Este modelo representa un enfoque fácilmente adaptable y manipulable basado en neuronas de mamíferos que utiliza fuentes celulares y sistemas de microscopía ampliamente disponibles. Por ejemplo, se expresa una variedad de proteínas patológicas (por ejemplo, que albergan modificaciones relacionadas con la enfermedad) para identificar cómo las modificaciones específicas de estas proteínas afectan el transporte en los axones. De manera similar, se puede usar una variedad de proteínas de carga marcadas con fluorescencia para examinar los cambios específicos de la carga. Además, los mecanismos moleculares subyacentes se estudian con relativa facilidad mediante la expresión dirigida (es decir, knockdown o sobreexpresión) de proteínas seleccionadas que pueden mediar estos efectos. Este método también se adapta fácilmente para neuronas primarias derivadas de una amplia variedad de modelos animales.

Presentamos un protocolo detallado que describe el ensayo de transporte de axones de células vivas que se utilizó previamente en neuronas primarias del hipocampo para demostrar que las proteínas tau mutantes asociadas con las demencias lobares frontotemporales (FTLD; P301L o R5L tau) aumentan la frecuencia de pausa de las proteínas de carga marcadas con fluorescencia bidireccionalmente¹². Además, la caída de la isoforma PP1γ rescató los efectos de pausa¹². Esto proporciona apoyo para el modelo de disrupción patológica inducida por tau que está mediada por la activación aberrante de una vía de señalización iniciada por PP1 como se describió anteriormente ^6,7,12. En un estudio separado, demostramos que la pseudofosforilación de tau en S199/S202/T205 (el fosfoepítopo patógeno AT8 relevante para las tauopatías) aumentó la frecuencia de pausa de la carga y la velocidad del segmento anterógrado. Estos efectos dependieron del dominio activador de la fosfatasa N-terminal de tau¹³. Estos ejemplos ponen de manifiesto la utilidad de este modelo para identificar los mecanismos de cómo las proteínas patológicas interrumpen el transporte de axones en neuronas de mamíferos.

Este artículo proporciona una descripción detallada del método, comenzando con la recolección, disociación y cultivo de neuronas primarias del hipocampo de ratón, seguido de la transfección de las neuronas con proteínas de carga fusionadas con una proteína fluorescente y, finalmente, el enfoque de imágenes de células vivas y análisis de imágenes. Demostramos cómo se utiliza este método para estudiar los efectos de la tau modificada en el transporte bidireccional de la proteína asociada a la vesícula, la sinaptofisina, por ejemplo. Sin embargo, existe flexibilidad en la proteína patógena y la proteína de carga de transporte de interés, lo que hace que este sea un enfoque versátil para estudiar el transporte axonal.