Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Neuronen sind auf den bidirektionalen Transport von Fracht entlang des Axons angewiesen, um funktionelle Synapsen und neuronale Konnektivität aufrechtzuerhalten. Es wird angenommen, dass axonale Transportdefizite entscheidend zur Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen beitragen, darunter die Alzheimer-Krankheit (AD) und andere Tauopathien, die Parkinson-Krankheit, die amyotrophe Lateralsklerose und die Huntington-Krankheit ^1,2,3. Tatsächlich wirken sich pathologische Modifikationen mehrerer krankheitsbezogener Proteine negativ auf den Transport aus (überprüft in ⁴). Die Entwicklung von Methoden zur Untersuchung der Mechanismen, durch die pathologische Proteine Toxizität bei Krankheiten ausüben, ist notwendig, um neurodegenerative Erkrankungen zu verstehen und potenzielle Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren.

Mehrere wichtige Erkenntnisse über den Axontransport, einschließlich der Entdeckung von konventionellem Kinesin, den Kinase- und Phosphatase-abhängigen Signalwegen, die Motorproteine regulieren, und Mechanismen, durch die pathologische Proteine die Regulation des Axontransports stören, wurden mit dem isolierten Tintenfisch-Axoplasma-Modell ^4,5 gewonnen. Die Perfusion des Tintenfisch-Axoplasmas mit pathologischen Formen des Tau-Proteins hemmt den anterograden schnellen axonalen Transport (FAT), ein Effekt, der von der Exposition der Phosphatase-aktivierenden Domäne von Tau abhängt, die die Proteinphosphatase 1 (PP1)^6,7,8 aktiviert. PP1 aktiviert die Glykogensynthase-Kinase 3 (GSK3), die wiederum Kinesin-Leichtketten phosphoryliert, was zur Freisetzung von Fracht führt. Ein weiteres pathologisches Protein bei AD ist Amyloid-β. Oligomere Formen von Amyloid-β hemmen bidirektionale FAT durch Caseinkinase 2, die Kinesin-Leichtketten phosphoryliert⁹. Darüber hinaus stören pathologische Huntingtin-Proteine, die eine Polyglutamin-Expansion beherbergen, und eine familiäre ALS-verknüpfte SOD1-Mutante jeweils den axonalen Transport im Axoplasma des Tintenfischs durch die c-Jun N-terminale Kinase bzw. die p38-Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Aktivität^10,11.

Während das Tintenfisch-Axoplasma-Modell nach wie vor ein wertvolles Werkzeug ist, um die Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport zu verstehen, verhindert der begrenzte Zugang zu den Geräten und Proben, dass es breiter eingesetzt wird. Wir haben einen Transportassay entwickelt, bei dem die konfokale Mikroskopie von primären Neuronen von Nagetieren (Maus und Ratte) verwendet wird. Dieses Modell stellt einen leicht anpassbaren und manipulierbaren neuronenbasierten Ansatz für Säugetiere dar, der weit verbreitete Zellquellen und Mikroskopiesysteme verwendet. Zum Beispiel wird eine Vielzahl von pathologischen Proteinen (z. B. die krankheitsbedingte Modifikationen beherbergen) exprimiert, um zu identifizieren, wie spezifische Modifikationen dieser Proteine den Transport in Axonen beeinflussen. In ähnlicher Weise kann eine Vielzahl von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen verwendet werden, um frachtspezifische Veränderungen zu untersuchen. Darüber hinaus lassen sich die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen relativ einfach untersuchen, indem die Expression (d.h. Knockdown oder Überexpression) ausgewählter Proteine, die diese Effekte vermitteln können, gezielt untersucht wird. Diese Methode lässt sich auch leicht an primäre Neuronen anpassen, die aus einer Vielzahl von Tiermodellen stammen.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll, das den Axontransport-Assay für lebende Zellen beschreibt, der zuvor in primären Hippocampus-Neuronen verwendet wurde, um zu zeigen, dass mutierte Tau-Proteine, die mit frontotemporalen Lobärdemenzen assoziiert sind (FTLD; P301L oder R5L tau) erhöhen die Pausenfrequenz von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen bidirektional¹². Darüber hinaus rettete der Knockdown der PP1γ-Isoform die Pausierungseffekte¹². Dies unterstützt das Modell der pathologischen Tau-induzierten Störung, die durch eine aberrante Aktivierung eines durch PP1 initiierten Signalwegs vermittelt wird, wie oben beschrieben ^6,7,12. In einer separaten Studie zeigten wir, dass die Pseudophosphorylierung von Tau an S199/S202/T205 (dem pathogenen AT8-Phosphoepitop, das für Tauopathien relevant ist) die Häufigkeit der Frachtpausen und die anterograde Segmentgeschwindigkeit erhöhte. Diese Effekte hingen von der N-terminalen Phosphatase-aktivierenden Domäne von Tau¹³ ab. Diese Beispiele unterstreichen die Nützlichkeit dieses Modells für die Identifizierung der Mechanismen, wie pathologische Proteine den Axontransport in Säugetierneuronen stören.

Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der Methode, beginnend mit der Ernte, Dissoziation und Kultivierung von primären Hippocampus-Neuronen der Maus, gefolgt von der Transfektion der Neuronen mit Frachtproteinen, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert sind, und schließlich dem Ansatz der Lebendzellbildgebung und Bildanalyse. Wir zeigen beispielsweise, wie diese Methode verwendet wird, um die Auswirkungen von modifiziertem Tau auf den bidirektionalen Transport des vesikelassoziierten Proteins Synaptophysin zu untersuchen. Es gibt jedoch Flexibilität in dem pathogenen Protein und dem Transportfrachtprotein, die von Interesse sind, was dies zu einem vielseitigen Ansatz zur Untersuchung des axonalen Transports macht.