Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

Os neurônios dependem do transporte bidirecional de carga ao longo do axônio para manter as sinapses funcionais e a conectividade neural. Acredita-se que os déficits de transporte axonal sejam contribuintes críticos para a patogênese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (DA) e outras tauopatias, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington ^1,2,3. De fato, modificações patológicas em várias proteínas relacionadas à doença afetam negativamente o transporte (revisado em ⁴). O desenvolvimento de métodos para investigar os mecanismos pelos quais as proteínas patológicas exercem toxicidade na doença é necessário para entender os distúrbios neurodegenerativos e identificar alvos potenciais para intervenção terapêutica.

Vários insights importantes sobre o transporte de axônios, incluindo a descoberta da cinesina convencional, as vias dependentes de quinase e fosfatase que regulam as proteínas motoras e os mecanismos pelos quais as proteínas patológicas interrompem a regulação do transporte de axônios, foram feitos usando o modelo isolado de axoplasma de lula ^4,5. A perfusão do axoplasma da lula com formas patológicas da proteína tau inibe o transporte axonal rápido anterógrado (FAT), um efeito dependente da exposição do domínio ativador da fosfatase da tau, que ativa a proteína fosfatase 1 (PP1)^6,7,8. O PP1 ativa a glicogênio sintase quinase 3 (GSK3), que por sua vez fosforila as cadeias leves de cinesina, causando a liberação de carga. Outra proteína patológica na DA é a β amilóide. As formas oligoméricas de β amilóide inibem o FAT bidirecional através da caseína quinase 2, que fosforila as cadeias leves de cinesina⁹. Além disso, a proteína huntingtina patológica que abriga uma expansão de poliglutamina e um mutante SOD1 ligado à ALS familiar interrompem o transporte axonal no axoplasma da lula através da quinase N-terminal c-Jun e da atividade da proteína quinase ativada por mitógeno p38, respectivamente^10,11.

Embora o modelo de axoplasma de lula continue a ser uma ferramenta valiosa na compreensão dos efeitos das proteínas patológicas no transporte axonal, o acesso limitado ao equipamento e às amostras impede que ele seja mais amplamente utilizado. Desenvolvemos um ensaio de transporte usando imagens de microscopia confocal de células vivas de neurônios primários de roedores (camundongos e ratos). Este modelo representa uma abordagem baseada em neurônios de mamíferos facilmente adaptável e manipulável usando fontes celulares e sistemas de microscopia amplamente disponíveis. Por exemplo, uma variedade de proteínas patológicas (por exemplo, que abrigam modificações relacionadas à doença) são expressas para identificar como modificações específicas dessas proteínas afetam o transporte nos axônios. Da mesma forma, uma variedade de proteínas de carga marcadas com fluorescência pode ser usada para examinar mudanças específicas de carga. Além disso, os mecanismos moleculares subjacentes são estudados com relativa facilidade, visando a expressão (ou seja, knockdown ou superexpressão) de proteínas selecionadas que podem mediar esses efeitos. Este método também é facilmente adaptado para neurônios primários derivados de uma ampla variedade de modelos animais.

Apresentamos um protocolo detalhado descrevendo o ensaio de transporte de axônios de células vivas que foi usado anteriormente em neurônios primários do hipocampo para mostrar que as proteínas tau mutantes associadas a demências lobares frontotemporais (FTLD; P301L ou R5L tau) aumentam a frequência de pausa de proteínas de carga marcadas com fluorescência bidirecionalmente¹². Além disso, o knockdown da isoforma PP1γ resgatou os efeitos de pausa¹². Isso fornece suporte para o modelo de interrupção patológica induzida por tau que é mediada pela ativação aberrante de uma via de sinalização iniciada por PP1, conforme descrito acima ^6,7,12. Em um estudo separado, mostramos que a pseudofosforilação de tau em S199 / S202 / T205 (o fosfoepítopo AT8 patogênico relevante para tauopatias) aumentou a frequência de pausa de carga e a velocidade do segmento anterógrado. Esses efeitos foram dependentes do domínio de ativação da fosfatase N-terminal da tau¹³. Esses exemplos destacam a utilidade desse modelo para identificar os mecanismos de como as proteínas patológicas interrompem o transporte de axônios em neurônios de mamíferos.

Este artigo fornece uma descrição detalhada do método, começando com a colheita, dissociação e cultura de neurônios primários do hipocampo de camundongos, seguida pela transfecção dos neurônios com proteínas de carga fundidas com uma proteína fluorescente e, finalmente, a abordagem de imagem e análise de imagem de células vivas. Demonstramos como esse método é usado para estudar os efeitos da tau modificada no transporte bidirecional da proteína associada à vesícula, sinaptofisina, por exemplo. No entanto, há flexibilidade na proteína patogênica e na proteína de carga de transporte de interesse, o que torna esta uma abordagem versátil para estudar o transporte axonal.