荧光染色脂滴分析与3D重建，用于肝脂肪变性评估

脂滴（LDs），通常被视为能量库，是介导脂质储存的特化细胞器，它们包括疏水性中性脂质核心，主要含有胆固醇酯和甘油三酯（TG），由磷脂单层^封装1，^2，3。

LD生物发生发生在内质网（ER）中，从三酰基甘油（TAG）和甾醇酯的合成开始。中性脂质以低浓度在ER双层的小叶之间扩散，但聚结成油状体，当其细胞内^{浓度增加时}，油状体从ER膜生长并芽成近球形液滴4。随后，来自ER双层和细胞质的蛋白质，特别是脂周（PLIN）蛋白家族，易位到LD的表面以促进出芽⁵，⁶，⁷，^8，9。

通过新的脂肪酸合成和LD融合或聚结，LD长成不同的大小。因此，不同细胞类型中LD的大小和数量差异很大。小液滴（直径300-800nm），被称为初始LD（iLDs），几乎可以由所有细胞形成⁴。在LD形成的后期，大多数细胞能够将一些iLD转化为更大的iLDs-膨胀LDs（eLDs直径>1μm）。然而，只有特定的细胞类型，如脂肪细胞和肝细胞，才有能力形成巨大或超大的LD（直径可达数十微米）^4，10。

LDs在调节细胞脂质代谢，抑制脂毒性，预防ER应激，线粒体功能障碍以及最终由游离脂肪酸（FAs）引起的细胞死亡方面起着非常重要的作用¹¹，¹²，^13，14。此外，LDs还与基因表达，病毒复制蛋白隔离以及膜运输和信号传导的调节有关¹⁵，^16，17。因此，LD生物发生的失调是与代谢综合征，肥胖，2型糖尿病（T2DM）和/或动脉硬化相关的慢性疾病的标志，仅举几例¹⁸，^19，20。

肝脏作为代谢中枢，主要负责通过储存和处理脂质的脂质代谢，因此，它不断受到脂毒性的威胁²¹。肝脂肪变性（HS）是一系列进行性肝病的共同特征，其特征是细胞内脂质以胞质LD的形式过度积累，最终可能导致肝脏代谢功能障碍，炎症和晚期非酒精性脂肪性肝病²²，²³，^24，25.当极低密度脂蛋白（VLDL）中脂肪酸氧化和作为甘油三酯输出的速率低于血浆和从头脂肪酸合成中摄取肝脂肪酸的速率时，就会发生HS26。脂质的肝脏蓄积通常以两种形式发生 – 微泡和大泡脂肪变性 – 并且它们显示出不同的细胞结构特征²⁷。通常，微泡性脂肪变性的特征是存在分散在整个肝细胞中的小LD，细胞核位于中央，而大泡性脂肪变性的特征是存在单个大LD，该LD占据肝细胞的大部分，将细胞核推向外围^28，29.值得注意的是，这两种类型的脂肪变性经常一起发现，目前尚不清楚这两种LD模式如何影响疾病发病机制，因为证据仍然不一致³¹，³²，^33，34。然而，这种类型的分析通常被用作临床前和临床研究中的“参考标准”，以了解LD的动态行为并表征肝脂肪变性²⁹，³⁴，^35，36。

肝活检是诊断和分级HS的金标准，通过组织学苏木精和伊红（H&E）分析常规评估，其中脂质液滴被评估为H&E染色肝脏切片中的未染色液泡³⁷。虽然可以接受大泡脂肪变性评估，但这种类型的染色通常会缩小微泡脂肪变性的评估范围³⁸。脂溶性重氮染料，如油红O（ORO），通常与明场显微镜结合使用以分析细胞内脂质储存，但这些仍然有许多缺点：（i）在染色过程中使用乙醇或异丙醇，尽管细胞是固定的，但这通常会导致天然LD的破坏和偶尔的融合³⁹;（ii）耗时，因为ORO溶液由于保质期有限而需要新鲜粉末溶解和过滤，从而导致结果不太一致;（iii）以及ORO不仅染色脂滴，而且经常高估肝脂肪变性的事实³⁸。

因此，细胞渗透性亲脂性荧光团（如尼罗红）已被用于活样品或固定样品中，以克服上述一些限制。然而，细胞脂质细胞器标记的非特异性性质反复缩小LD评估的范围⁴⁰。此外，尼罗河红的光谱特性根据环境的极性而变化，这通常会导致光谱偏移⁴¹。

亲脂性荧光探针1，3，5，7，8-五甲基-4-硼-3a，4adiaza-s-茚达烯（激发波长：480nm;最大发射波长：515nm;BODIPY 493/503）表现出疏水性特性，允许其被细胞内LD快速吸收，积聚在脂滴核心中，随后发出亮绿色荧光¹²。与尼罗红不同，BODIPY 493/503对环境极性不敏感，并且已被证明具有更高的选择性，因为它在LD成像中显示出高亮度。为了染色中性LD，该染料可用于活细胞或固定细胞，并成功与其他染色和/或标记方法偶联⁴²。染料的另一个优点是它几乎不需要努力地放入溶液中并且是稳定的，因此无需为每个实验新鲜制备⁴²。尽管BODIPY 493/503探针已成功用于可视化细胞培养物中LD的定位和动力学，但一些报告也证明了这种染料在组织中的LD成像工具的可靠使用，包括人股外侧肌⁴³，大鼠比目鱼肌⁴²和小鼠肠道⁴⁴。

在本文中，我们提出了一种优化的基于 BODIPY 493/503 的方案，作为评估肝脂肪变性动物模型中肝脏标本中 LD 数、面积和直径的替代分析方法。该程序包括肝脏样本制备、组织切片、染色条件、图像采集和数据分析。