Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

Lipidedruppels (LDs), klassiek gezien als energiedepots, zijn gespecialiseerde cellulaire organellen die lipidenopslag bemiddelen, en ze omvatten een hydrofobe neutrale lipidekern, die voornamelijk cholesterolesters en triglyceriden (TG’s) bevat, ingekapseld door een fosfolipide monolaag ^1,2,3.

LD-biogenese vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER), te beginnen met de synthese van triacylglycerol (TAG) en sterolesters. Neutrale lipiden worden in lage concentraties verspreid tussen de blaadjes van de ER-dubbellaag, maar smelten samen tot olielenzen die groeien en toppen tot bijna bolvormige druppels van het ER-membraan wanneer hun intracellulaire concentratie toeneemt⁴. Vervolgens transloceren eiwitten uit de ER-dubbellaag en cytosol, met name de perilipine (PLIN) eiwitfamilie, naar de oppervlakken van de LDs om^ontluiking 5,6,7,8,9 te vergemakkelijken.

Door nieuwe vetzuursynthese en LD-fusie of coalescentie groeien LD’s in verschillende groottes. Dienovereenkomstig verschillen de grootte en het aantal LD’s aanzienlijk tussen verschillende celtypen. Kleine druppeltjes (300-800 nm diameter), die bekend staan als initiële LDs (iLDs), kunnen door bijna alle cellen worden gevormd⁴. Later in LD-vorming zijn de meeste cellen in staat om sommige iLDs om te zetten in grotere LDs (eLDs >1 μm in diameter). Toch hebben alleen specifieke celtypen, zoals adipocyten en hepatocyten, de capaciteit om gigantische of supersized LDs te vormen (tot tientallen microns in diameter)^4,10.

LDs spelen een zeer belangrijke rol bij de regulatie van cellulair lipidenmetabolisme, het onderdrukken van lipotoxiciteit en het voorkomen van ER-stress, mitochondriale disfunctie en, uiteindelijk, celdood veroorzaakt door vrije vetzuren (FAs)^11,12,13,14. Bovendien zijn LDs ook betrokken bij de regulatie van genexpressie, virale replicatie-eiwitsekwestratie en membraanhandel en signalering^15,16,17. Daarom is de misregulatie van LD-biogenese een kenmerk van chronische ziekten geassocieerd met metabool syndroom, obesitas, type 2 diabetes mellitus (T2DM) en / of aderverkalking, om er maar een paar te noemen^18,19,20.

De lever, als een metabole hub, is meestal verantwoordelijk voor het lipidenmetabolisme door lipiden op te slaan en te verwerken, en daarom wordt het voortdurend bedreigd door lipotoxiciteit²¹. Hepatische steatose (HS) is een gemeenschappelijk kenmerk van een reeks progressieve leverziekten en wordt gekenmerkt door overmatige intracellulaire lipideaccumulatie in de vorm van cytosolische LDs die uiteindelijk kunnen leiden tot leverstofwisselingsstoornissen, ontsteking en geavanceerde vormen van niet-alcoholische leververvetting^22,23,24,25. HS treedt op wanneer de snelheid van vetzuuroxidatie en export als triglyceriden in lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL’s) lager is dan de snelheid van opname van levervetzuren uit het plasma en de novo vetzuursynthese²⁶. De hepatische accumulatie van lipiden komt vaak voor in twee vormen – microvesiculaire en macrovesiculaire steatose – en deze vertonen verschillende cytoarchitectonische kenmerken²⁷. Typisch wordt microvesiculaire steatose gekenmerkt door de aanwezigheid van kleine LDs verspreid over de hepatocyt met de kern centraal geplaatst, terwijl macrovesiculaire steatose wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een enkele grote LD die het grootste deel van de hepatocyt bezet, waardoor de kern naar de periferie wordt geduwd^28,29. Met name deze twee soorten steatose worden vaak samen gevonden, en het blijft onduidelijk hoe deze twee LD-patronen de pathogenese van de ziekte beïnvloeden, omdat het bewijs nog steeds inconsistent is^31,32,33,34. Toch wordt een dergelijk type analyse vaak gebruikt als een “referentiestandaard” in preklinische en klinische studies om het dynamische gedrag van LDs te begrijpen en hepatische steatose te karakteriseren 29,34,35,36.

Leverbiopten, de gouden standaard voor het diagnosticeren en beoordelen van HS, worden routinematig beoordeeld door histologische hematoxyline en eosine (H &E) analyse, waarbij lipidedruppels worden geëvalueerd als niet-gekleurde vacuolen in H & E-gekleurde leversecties³⁷. Hoewel acceptabel voor macrovesiculaire steatose-evaluatie, beperkt dit type kleuring over het algemeen de beoordeling van microvesiculaire steatose³⁸. Lipide-oplosbare diazokleurstoffen, zoals Oil Red O (ORO), worden klassiek gecombineerd met brightfieldmicroscopie om intracellulaire lipidenvoorraden te analyseren, maar deze hebben nog steeds een aantal nadelen: (i) het gebruik van ethanol of isopropanol in het kleuringsproces, wat vaak de verstoring van de inheemse LDs en occasionele fusie veroorzaakt, ondanks dat de cellen worden gefixeerd³⁹; ii) het tijdrovende karakter, aangezien de ORO-oplossing vanwege de beperkte houdbaarheid moet worden opgelost en gefiltreerd door vers poeder, wat bijdraagt tot minder consistente resultaten; (iii) en het feit dat ORO meer kleurt dan alleen lipidedruppeltjes en vaak hepatische steatose overschat³⁸.

Bijgevolg zijn celdoorlatende lipofiele fluoroforen, zoals Nile Red, gebruikt in levende of vaste monsters om enkele van de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. De niet-specifieke aard van cellulaire lipideorganeletikettering vernauwt echter herhaaldelijk LD-beoordelingen⁴⁰. Bovendien variëren de spectrale eigenschappen van Nijlrood afhankelijk van de polariteit van de omgeving, wat vaak kan leiden tot spectrale verschuivingen⁴¹.

De lipofiele fluorescerende sonde 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceen (excitatiegolflengte: 480 nm; emissiemaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) vertoont hydrofobiciteitskenmerken die een snelle opname door intracellulaire LDs mogelijk maken, zich ophopen in de lipidedruppelkern en vervolgens heldergroene fluorescentie uitzenden¹². In tegenstelling tot Nile Red is BODIPY 493/503 ongevoelig voor de omgevingspolariteit en is aangetoond dat het selectiever is, omdat het een hoge helderheid weergeeft voor LD-beeldvorming. Om neutrale LDs te kleuren, kan deze kleurstof worden gebruikt in levende of vaste cellen en met succes worden gekoppeld aan andere kleurings- en / of etiketteringsmethoden⁴². Een ander voordeel van de kleurstof is dat het weinig moeite kost om in een oplossing te plaatsen en stabiel is, waardoor het niet nodig is om het voor elk experiment vers te bereiden⁴². Hoewel de BODIPY 493/503-sonde met succes is gebruikt om de lokalisatie en dynamiek van LDs in celculturen te visualiseren, hebben sommige rapporten ook het betrouwbare gebruik van deze kleurstof aangetoond als een LD-beeldvormingstool in weefsels, waaronder de menselijke vastus lateralis-spier⁴³, de rat soleus-spier 42 en de muizendarm⁴⁴.

Hierin stellen we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503-gebaseerd protocol voor als een alternatieve analytische benadering voor de evaluatie van het LD-aantal, het gebied en de diameter in levermonsters van een diermodel van leversteatose. Deze procedure omvat de voorbereiding van levermonsters, weefselsecties, kleuringscondities, beeldacquisitie en gegevensanalyse.