Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.
As gotículas lipídicas (DLs) são organelas especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e desempenham um papel muito importante na supressão da lipotoxicidade e na prevenção da disfunção causada pelos ácidos graxos livres (AGs). O fígado, dado seu papel crítico no metabolismo da gordura do corpo, é persistentemente ameaçado pelo acúmulo intracelular de DLs na forma de esteatose hepática microvesicular e macrovesicular. A caracterização histológica dos LDs é tipicamente baseada em corantes diazo lipossolúveis, como a coloração Oil Red O (ORO), mas uma série de desvantagens consistentemente dificulta o uso dessa análise com espécimes hepáticos. Mais recentemente, os fluoróforos lipofílicos 493/503 tornaram-se populares para visualizar e localizar DLs devido à sua rápida captação e acúmulo no núcleo de gotículas lipídicas neutras. Embora a maioria das aplicações seja bem descrita em culturas celulares, há menos evidências demonstrando o uso confiável de sondas de fluoróforo lipofílico como uma ferramenta de imagem de DL em amostras de tecido. Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em dipirrometeno de boro (BODIPY) 493/503 para a avaliação de DLs em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática induzida por dieta hiperlipídica (DHL). Este protocolo abrange preparo de amostras de fígado, secção tecidual, coloração BODIPY 493/503, aquisição de imagens e análise de dados. Demonstramos um aumento do número, intensidade, razão de área e diâmetro das DLs hepáticas após a alimentação com DH. Usando projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar o conteúdo total de lipídios neutros no núcleo LD, que apareceu como gotículas quase esféricas. Além disso, com o fluoróforo BODIPY 493/503, conseguimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermediárias (3 μm 9 μm), permitindo a discriminação bem sucedida da esteatose microvesicular e macrovesicular. Em geral, este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL hepática e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos.
As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica 1,2,3.
A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentrações, mas coalescem em lentes de óleo que crescem e brotam em gotículas quase esféricas da membrana de RE quando sua concentração intracelular aumenta4. Posteriormente, proteínas da bicamada de RE e do citosol, particularmente da família de proteínas perilipina (PLIN), translocam-se para as superfícies dos DLs para facilitar o brotamento 5,6,7,8,9.
Através de nova síntese de ácidos graxos e fusão ou coalescência de LD, LDs crescem em diferentes tamanhos. Assim, o tamanho e o número de LDs diferem consideravelmente entre os diferentes tipos de células. Pequenas gotículas (300-800 nm de diâmetro), conhecidas como DLs iniciais (iLDs), podem ser formadas por quase todas as células4. Mais tarde na formação de LD, a maioria das células é capaz de converter algumas iLDs em LDs maiores de expansão (eLDs >1 μm de diâmetro). No entanto, apenas tipos celulares específicos, como adipócitos e hepatócitos, têm a capacidade de formar LDs gigantes ou superdimensionadas (até dezenas de mícrons de diâmetro)4,10.
Os DLs desempenham um papel muito importante na regulação do metabolismo lipídico celular, suprimindo a lipotoxicidade e prevenindo o estresse de RE, a disfunção mitocondrial e, finalmente, a morte celular causada pelos ácidos graxos livres (AGs)11,12,13,14. Além disso, as DLs também têm sido implicadas na regulação da expressão gênica, no sequestro de proteínas de replicação viral, no tráfego e sinalização de membranas15,16,17. Portanto, a desregulação da biogênese da DL é uma característica das doenças crônicas associadas à síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e/ou arteriosclerose, para citar apenas algumas18,19,20.
O fígado, como polo metabólico, é o principal responsável pelo metabolismo lipídico, armazenando e processando lipídios, sendo, portanto, constantemente ameaçado pela lipotoxicidade21. A esteatose hepática (EH) é uma característica comum a uma série de doenças hepáticas progressivas e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de lipídios intracelulares na forma de LDs citosólicos que, em última instância, podem levar à disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica22,23,24,25. A SH ocorre quando a taxa de oxidação de ácidos graxos e exportação como triglicerídeos dentro de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs) é menor do que a taxa de captação de ácidos graxos hepáticos do plasma e síntese de novos ácidos graxos26. O acúmulo hepático de lipídios frequentemente ocorre em duas formas – esteatose microvesicular e macrovesicular – e estas apresentam características citoarquitetônicasdistintas27. Tipicamente, a esteatose microvesicular é caracterizada pela presença de pequenos DLs dispersos por todo o hepatócito com o núcleo posicionado centralmente, enquanto a esteatose macrovesicular é caracterizada pela presença de um único grande DL que ocupa a maior parte do hepatócito, empurrando o núcleo para a periferia28,29. Notavelmente, esses dois tipos de esteatose são frequentemente encontrados juntos, e ainda não está claro como esses dois padrões de DL influenciam a patogênese da doença, pois as evidências ainda são inconsistentes31,32,33,34. No entanto, esse tipo de análise é frequentemente empregado como “padrão de referência” em estudos pré-clínicos e clínicos para entender o comportamento dinâmico dos DLs e caracterizar a esteatose hepática29,34,35,36.
As biópsias hepáticas, padrão-ouro para o diagnóstico e classificação da EH, são rotineiramente avaliadas pela análise histológica de hematoxilina e eosina (H&E), onde gotículas lipídicas são avaliadas como vacúolos não corados em cortes hepáticos corados por H&E37. Embora aceitável para avaliação da esteatose macrovesicular, esse tipo de coloração geralmente estreita a avaliação da esteatose microvesicular38. Corantes diazo lipossolúveis, como o Oil Red O (ORO), são classicamente combinados com microscopia de campo claro para analisar os estoques lipídicos intracelulares, mas estes ainda apresentam uma série de desvantagens: (i) o uso de etanol ou isopropanol no processo de coloração, o que muitas vezes causa a ruptura dos LDs nativos e fusão ocasional apesar das células estarem fixas39; (ii) a natureza demorada, uma vez que a solução de ORO requer dissolução e filtragem de pó fresco devido ao prazo de validade limitado, contribuindo assim para resultados menos consistentes; (iii) e o fato de que a ORO cora mais do que apenas gotículas lipídicas e muitas vezes superestima a esteatose hepática38.
Consequentemente, fluoróforos lipofílicos permeáveis a células, como o Nile Red, têm sido usados em amostras vivas ou fixas para superar algumas das limitações mencionadas. No entanto, a natureza inespecífica da marcação de organelas lipídicas celulares restringe repetidamente as avaliações de DL40. Além disso, as propriedades espectrais do Vermelho do Nilo variam de acordo com a polaridade do ambiente, o que muitas vezes pode levar a deslocamentos espectrais41.
A sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (comprimento de onda de excitação: 480 nm; emissão máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) apresenta características de hidrofobicidade que permitem sua rápida captação pelos LDs intracelulares, acumula-se no núcleo lipídico das gotículas e, posteriormente, emite fluorescência verde brilhante12. Ao contrário do Nile Red, o BODIPY 493/503 é insensível à polaridade do ambiente e tem se mostrado mais seletivo, pois exibe alto brilho para imagens LD. Para corar LDs neutros, esse corante pode ser usado em células vivas ou fixas e acoplado com sucesso a outros métodos de coloração e/ou marcação42. Outra vantagem do corante é que ele requer pouco esforço para ser colocado em uma solução e é estável, eliminando a necessidade de prepará-lo na hora para cada experimento42. Embora a sonda BODIPY 493/503 tenha sido empregada com sucesso para visualizar a localização e dinâmica de DLs em culturas celulares, alguns relatos também demonstraram o uso confiável desse corante como ferramenta de imagem de DL em tecidos, incluindo o músculo vasto lateral humano43, o músculo sóleo de rato 42 e o intestino de camundongo44.
Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em BODIPY 493/503 como uma abordagem analítica alternativa para a avaliação do número, área e diâmetro de DL em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática. Esse procedimento abrange o preparo de amostras de fígado, corte tecidual, condições de coloração, aquisição de imagens e análise de dados.
Este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para avaliação de DL teve como objetivo desenvolver uma nova abordagem de imagem para a avaliação da esteatose hepática. Dada a forte correlação entre obesidade e doença hepática gordurosa, a dieta hiperlipídica de estilo ocidental foi utilizada para estabelecer um modelo animal de esteatose hepática26. Um aumento robusto no conteúdo hepático de TG foi confirmado por um kit de ensaio colorimétrico quantitativo de triglicerídeos…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigação foi financiada por fundos nacionais e europeus através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Os autores agradecem o apoio do iLAB – Laboratório de Microscopia e Bioimagem, unidade da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e membro da infraestrutura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de BioImagem (POCI-01-0145-FEDER-022122), bem como o apoio do FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.
1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set | Fisher Scientific | ||
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D3922 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR | D1306 | |
70% ethanol | Honeywell | 10191455 | |
Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
Automatic analyzer Hitachi 717 | Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany | 8177-30-0010 | |
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) | Daido Sangyo Co., Ltd, Japon | _ | |
Blade | Leica | 221052145 | Used in the cryostat |
Cell Profiler version 4.2.5 | https://cellprofiler.org/releases/ | Used to analyse the acquired images | |
Coverslips | Menzel-Glaser, Germany | _ | |
Cryomolds | Tissue-Tek | _ | |
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S | Leica Biosystems | _ | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | D-8418 | Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Dry ice container (styrofoam cooler) | Novolab | A26742 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools, Germany | 11295-10 | |
Glass Petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) |
Thermo Scientific | 150318 | Used to weigh the liver after dissection |
Glycergel | DAKO Omnis | S303023 | |
GraphPad Prism software, version 9.3.1 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA | ||
High-fat diet | Envigo, Barcelona, Spain | MD.08811 | |
Ketamine (Nimatek 100 mg/mL) | Dechra | 791/01/14DFVPT | Used at a final concentration of 75 mg/kg |
Laser scanning confocal microscope (QUASAR detection unit; ) | Carl Zeiss, germany | LSM 710 Axio Observer Z1 microscope | |
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Dechra | 1838 ESP / 020/01/07RFVPT | Used at a final concentration of 1 mg/kg |
Needle | BD microlance | 300635 | |
No 15 Sterile carbon steel scalpel Blade |
Swann-Morton | 205 | |
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) | Carl Zeiss, Germany | ||
Paint brushes | Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections | |
Peristaltic pump (Minipuls 3) | Gilson | 1004170 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) | Sigma-Aldrich, Lyon, France | P3813 | |
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 | Swann-Morton | 0208 | |
Slide staining system StainTray | Simport Scientific | M920 | |
Standard diet | Mucedola | 4RF21 | |
Superfrost Plus microscope slides | Menzel-Glaser, Germany | J1800AMNZ | |
Tissue-Tek OCT mounting media | VWR CHEMICALS | 361603E | |
Triglycerides colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 10010303 | |
Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | TK 52 | |
Vannas spring scissors – 3 mm cutting edge |
Fine Science Tools, Germany | 15000-00 | |
ZEN Black software | Zeiss |