Summary

Analyse de gouttelettes lipidiques colorées par fluorescence avec reconstruction 3D pour l’évaluation de la stéatose hépatique

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

Ici, nous démontrons un protocole optimisé basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 pour la caractérisation des gouttelettes lipidiques dans le tissu hépatique. Grâce à l’utilisation de projections orthogonales et de reconstructions 3D, le fluorophore permet une discrimination réussie entre la stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques pour l’évaluation de la stéatose hépatique.

Abstract

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides et jouent un rôle très important dans la suppression de la lipotoxicité et la prévention du dysfonctionnement causé par les acides gras libres (AG). Le foie, compte tenu de son rôle essentiel dans le métabolisme des graisses du corps, est constamment menacé par l’accumulation intracellulaire de LD sous forme de stéatose hépatique microvésiculaire et macrovésiculaire. La caractérisation histologique des LD est généralement basée sur des colorants diazoélectriques liposolubles, tels que la coloration Oil Red O (ORO), mais un certain nombre d’inconvénients entravent systématiquement l’utilisation de cette analyse avec des échantillons de foie. Plus récemment, les fluorophores lipophiles 493/503 sont devenus populaires pour visualiser et localiser les LD en raison de leur absorption et de leur accumulation rapides dans le noyau de gouttelettes lipidiques neutres. Même si la plupart des applications sont bien décrites dans les cultures cellulaires, il y a moins de preuves démontrant l’utilisation fiable des sondes fluorophores lipophiles comme outil d’imagerie LD dans les échantillons de tissus. Nous proposons ici un protocole optimisé basé sur le dipyrrométène de bore (BODIPY) 493/503 pour l’évaluation des LD dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique induite par un régime riche en graisses (HFD). Ce protocole couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, la coloration BODIPY 493/503, l’acquisition d’images et l’analyse des données. Nous démontrons une augmentation du nombre, de l’intensité, du rapport de surface et du diamètre des LD hépatiques lors de l’alimentation HFD. En utilisant des projections orthogonales et des reconstructions 3D, il a été possible d’observer la teneur complète en lipides neutres dans le noyau LD, qui apparaissait comme des gouttelettes presque sphériques. De plus, avec le fluorophore BODIPY 493/503, nous avons pu distinguer des microvésicules (1 μm < j ≤ 3 μm), des vésicules intermédiaires (3 μm 9 μm), permettant la discrimination réussie de la stéatose microvésiculaire et macrovésiculaire. Dans l’ensemble, ce protocole basé sur la fluorescence BODIPY 493/503 est un outil fiable et simple pour la caractérisation hépatique de la LD et peut représenter une approche complémentaire aux protocoles histologiques classiques.

Introduction

Les gouttelettes lipidiques (LD), classiquement considérées comme des dépôts d’énergie, sont des organites cellulaires spécialisés qui interviennent dans le stockage des lipides, et elles comprennent un noyau lipidique neutre hydrophobe, qui contient principalement des esters de cholestérol et des triglycérides (TG), encapsulés par une monocouche phospholipide 1,2,3.

La biogenèse de la LD se produit dans le réticulum endoplasmique (RE), en commençant par la synthèse du triacylglycérol (TAG) et des esters stéroliques. Les lipides neutres sont diffusés entre les folioles de la bicouche ER à de faibles concentrations, mais fusionnent en lentilles d’huile qui se développent et bourgeonnent en gouttelettes presque sphériques de la membrane ER lorsque leur concentration intracellulaire augmente4. Par la suite, les protéines de la bicouche ER et du cytosol, en particulier la famille des protéines perilipin (PLIN), se transloquent à la surface des LD pour faciliter le bourgeonnement 5,6,7,8,9.

Grâce à la synthèse de nouveaux acides gras et à la fusion ou à la coalescence des LD, les LD atteignent différentes tailles. Par conséquent, la taille et le nombre de TA diffèrent considérablement d’un type de cellules à l’autre. De petites gouttelettes (300-800 nm de diamètre), connues sous le nom de LD initiales (iLD), peuvent être formées par presque toutes les cellules4. Plus tard dans la formation de LD, la plupart des cellules sont capables de convertir certaines iLD en LD plus grandes en expansion (eLDs >1 μm de diamètre). Pourtant, seuls des types cellulaires spécifiques, tels que les adipocytes et les hépatocytes, ont la capacité de former des LD géantes ou surdimensionnées (jusqu’à des dizaines de microns de diamètre)4,10.

Les LD jouent un rôle très important dans la régulation du métabolisme des lipides cellulaires, la suppression de la lipotoxicité et la prévention du stress des urgences, du dysfonctionnement mitochondrial et, finalement, de la mort cellulaire causée par les acides gras libres (AG)11,12,13,14. En outre, les LD ont également été impliqués dans la régulation de l’expression génique, la séquestration des protéines de réplication virale et le trafic et la signalisationmembranaires 15,16,17. Par conséquent, la mauvaise régulation de la biogenèse de la ML est une caractéristique des maladies chroniques associées au syndrome métabolique, à l’obésité, au diabète sucré de type 2 (DT2) et / ou à l’artériosclérose, pour n’en nommer quequelques-unes 18,19,20.

Le foie, en tant que plaque tournante métabolique, est principalement responsable du métabolisme des lipides en stockant et en traitant les lipides et, par conséquent, il est constamment menacé par la lipotoxicité21. La stéatose hépatique (SH) est une caractéristique commune d’une série de maladies hépatiques progressives et se caractérise par une accumulation excessive de lipides intracellulaires sous forme de LD cytosoliques qui, en fin de compte, peuvent entraîner un dysfonctionnement métabolique hépatique, une inflammation et des formes avancées de stéatose hépatique non alcoolique22,23,24,25. L’HS se produit lorsque le taux d’oxydation et d’exportation des acides gras sous forme de triglycérides dans les lipoprotéines de très basse densité (VLDL) est inférieur au taux d’absorption hépatique des acides gras par le plasma et la synthèse de novo des acides gras26. L’accumulation hépatique de lipides se produit souvent sous deux formes – stéatose microvésiculeuse et macrovésiculeuse – et celles-ci présentent des caractéristiques cytoarchitectoniques distinctes27. Typiquement, la stéatose microvésiculeuse est caractérisée par la présence de petites LD dispersées dans tout l’hépatocytes avec le noyau placé au centre, tandis que la stéatose macrovésiculeuse est caractérisée par la présence d’une seule grande LD qui occupe la plus grande partie de l’hépatocytes, poussant le noyau vers la périphérie28,29. Notamment, ces deux types de stéatose sont souvent trouvés ensemble, et on ne sait toujours pas comment ces deux modèles de LD influencent la pathogenèse de la maladie, car les preuves sont encore incohérentes 31,32,33,34. Pourtant, ce type d’analyse est souvent utilisé comme « norme de référence » dans les études précliniques et cliniques pour comprendre le comportement dynamique des TA et caractériser la stéatose hépatique 29,34,35,36.

Les biopsies hépatiques, l’étalon-or pour le diagnostic et le classement de l’HS, sont systématiquement évaluées par analyse histologique de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E), où les gouttelettes lipidiques sont évaluées comme des vacuoles non colorées dans les sections hépatiques colorées H & E37. Bien qu’acceptable pour l’évaluation de la stéatose macrovésiculaire, ce type de coloration restreint généralement l’évaluation de la stéatose microvésiculeuse38. Les colorants diazoélectriques liposolubles, tels que l’Oil Red O (ORO), sont classiquement combinés à la microscopie à fond clair pour analyser les réserves lipidiques intracellulaires, mais ceux-ci présentent encore un certain nombre d’inconvénients: (i) l’utilisation d’éthanol ou d’isopropanol dans le processus de coloration, ce qui provoque souvent la perturbation des LD natives et une fusion occasionnelle malgré la fixation des cellules39; ii) la nature longue, car la solution ORO nécessite la dissolution et la filtration de la poudre fraîche en raison de la durée de conservation limitée, ce qui contribue à des résultats moins cohérents; (iii) et le fait que l’ORO colore plus que de simples gouttelettes lipidiques et surestime souvent la stéatose hépatique38.

Par conséquent, des fluorophores lipophiles perméables aux cellules, tels que le rouge du Nil, ont été utilisés dans des échantillons vivants ou fixes pour surmonter certaines des limitations susmentionnées. Cependant, la nature non spécifique du marquage des organites lipidiques cellulaires rétrécit à plusieurs reprises les évaluations de la LD40. De plus, les propriétés spectrales du Rouge du Nil varient en fonction de la polarité de l’environnement, ce qui peut souvent conduire à des décalagesspectraux41.

La sonde fluorescente lipophile 1,3,5,7,8-pentaméthyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (longueur d’onde d’excitation : 480 nm ; émission maximale : 515 nm ; BODIPY 493/503) présente des caractéristiques d’hydrophobicité qui permettent son absorption rapide par les LD intracellulaires, s’accumule dans le noyau des gouttelettes lipidiques et, par la suite, émet une fluorescence vert vif12. Contrairement au Nile Red, BODIPY 493/503 est insensible à la polarité de l’environnement et s’est avéré plus sélectif, car il affiche une luminosité élevée pour l’imagerie LD. Afin de colorer les LD neutres, ce colorant peut être utilisé dans des cellules vivantes ou fixes et couplé avec succès à d’autres méthodes de coloration et/ou d’étiquetage42. Un autre avantage du colorant est qu’il nécessite peu d’effort pour être placé dans une solution et qu’il est stable, éliminant ainsi le besoin de le préparer fraîchement pour chaque expérience42. Même si la sonde BODIPY 493/503 a été utilisée avec succès pour visualiser la localisation et la dynamique des TA dans les cultures cellulaires, certains rapports ont également démontré l’utilisation fiable de ce colorant comme outil d’imagerie des LD dans les tissus, y compris le muscle vastus lateralis humain43, le muscle soléaire du rat 42 et l’intestin de souris44.

Ici, nous proposons un protocole optimisé basé sur BODIPY 493/503 comme approche analytique alternative pour l’évaluation du nombre de DL, de la surface et du diamètre dans des échantillons de foie à partir d’un modèle animal de stéatose hépatique. Cette procédure couvre la préparation des échantillons de foie, la section des tissus, les conditions de coloration, l’acquisition d’images et l’analyse des données.

Protocol

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par l’organisme de protection des animaux de l’Institut de recherche clinique et biomédicale de Coimbra (IBRC) (ORBEA, #9/2018) et étaient conformes aux directives nationales et européennes sur les soins aux animaux et aux directives ARRIVE. 1. Conception expérimentale Couple de rats Wistar mâles âgés de 13 semaines dans des cages ventilées dans des conditions environnemen…

Representative Results

L’exécution réussie de cette technique devrait entraîner une coloration claire des gouttelettes lipidiques pour la caractérisation simultanée de la morphologie LD (forme et densité du noyau lipidique basée sur la reconstruction 3D) ainsi que de leur distribution spatiale, de leur nombre par surface totale et de leur taille moyenne (évaluée avec le pipeline décrit ci-dessus, Figure 1). <img alt="Figure 1" class…

Discussion

Ce protocole BODIPY 493/503 basé sur la fluorescence pour l’évaluation de la LD visait à développer une nouvelle approche d’imagerie pour l’évaluation de la stéatose hépatique. Compte tenu de la forte corrélation entre l’obésité et la stéatose hépatique, le régime alimentaire riche en graisses de style occidental a été utilisé pour établir un modèle animal de stéatosehépatique 26. Une forte augmentation de la teneur en TG hépatique a été confirmée par un kit de dosa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par des fonds nationaux et européens via la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), le Fonds européen de développement régional (FEDER) et le Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) et POCI-01-0145-FEDER-007440. Les auteurs tiennent à remercier iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, une installation de la Faculté de médecine de l’Université de Coimbra et membre de l’infrastructure nationale PPBI-Plateforme portugaise de bioimagerie (POCI-01-0145-FEDER-022122), ainsi que le soutien de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)
Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade
Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm
cutting edge
Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

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Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

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