تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

قطرات الدهون (LDs) ، التي ينظر إليها تقليديا على أنها مستودعات للطاقة ، هي عضيات خلوية متخصصة تتوسط في تخزين الدهون ، وهي تتألف من نواة دهنية محايدة كارهة للماء ، والتي تحتوي بشكل أساسي على استرات الكوليسترول والدهون الثلاثية (TGs) ، مغلفة بطبقة أحادية فوسفوليبيد¹،^2،3.

يحدث التكوين الحيوي LD في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، بدءا من تخليق ثلاثي الجلسرين (TAG) واسترات الستيرول. تنتشر الدهون المحايدة بين وريقات الطبقة المزدوجة ER بتركيزات منخفضة ولكنها تتجمع في عدسات زيتية تنمو وتنبت في قطرات كروية تقريبا من غشاء ER عندما يزيد تركيزها داخل الخلايا⁴. بعد ذلك ، تنتقل البروتينات من طبقة ER المزدوجة والعصارة الخلوية ، وخاصة عائلة بروتين perilipin (PLIN) ، إلى أسطح LDs لتسهيل التبرعم⁵،⁶،⁷،^8،9.

من خلال تخليق الأحماض الدهنية الجديدة واندماج LD أو الاندماج ، تنمو LDs إلى أحجام مختلفة. وفقا لذلك ، يختلف حجم وعدد LDs اختلافا كبيرا عبر أنواع الخلايا المختلفة. يمكن تشكيل قطرات صغيرة (قطرها 300-800 نانومتر) ، والتي تعرف باسم LDs الأولية (iLDs) ، بواسطة جميع الخلايا⁴ تقريبا. في وقت لاحق من تكوين LD ، تكون معظم الخلايا قادرة على تحويل بعض iLDs إلى LDs أكبر حجما (قطرها > 1 ميكرومتر). ومع ذلك ، فإن أنواعا معينة فقط من الخلايا ، مثل الخلايا الشحمية وخلايا الكبد ، لديها القدرة على تكوين LDs عملاقة أو كبيرة الحجم (يصل قطرها إلى عشرات الميكرونات)^4,10.

تلعب LDs دورا مهما جدا في تنظيم استقلاب الدهون الخلوية ، وقمع السمية الدهنية ، ومنع إجهاد ER ، واختلال وظائف الميتوكوندريا ، وفي النهاية موت الخلايا الناجم عن الأحماض الدهنية الحرة (FAs) ¹¹،¹²،^13،14. علاوة على ذلك ، تورطت LDs أيضا في تنظيم التعبير الجيني ، وعزل بروتين التكاثر الفيروسي ، والاتجار بالأغشية والإشارة¹⁵،^16،17. لذلك ، فإن سوء تنظيم التكوين الحيوي LD هو السمة المميزة للأمراض المزمنة المرتبطة بمتلازمة التمثيل الغذائي ، والسمنة ، وداء السكري من النوع 2 (T2DM) ، و / أو تصلب الشرايين ، على سبيل المثال لا الحصر¹⁸،^19،20.

الكبد ، كمركز استقلابي ، مسؤول في الغالب عن استقلاب الدهون عن طريق تخزين ومعالجة الدهون ، وبالتالي ، فهو مهدد باستمرار بالسمية الدهنية²¹. التنكس الدهني الكبدي (HS) هو سمة شائعة لسلسلة من أمراض الكبد التقدمية ويتميز بتراكم الدهون المفرط داخل الخلايا في شكل LDs الخلوية التي قد تؤدي في النهاية إلى خلل وظيفي في التمثيل الغذائي في الكبد ، والتهاب ، وأشكال متقدمة من مرض الكبد الدهني غير الكحولي²²،²³،^24،25. يحدث HS عندما يكون معدل أكسدة الأحماض الدهنية وتصديرها كدهون ثلاثية داخل البروتينات الدهنية منخفضة الكثافة (VLDLs) أقل من معدل امتصاص الأحماض الدهنية الكبدية من البلازما وتخليق الأحماض الدهنية الجديدة ²⁶. غالبا ما يحدث التراكم الكبدي للدهون في شكلين – التنكس الدهني الحويصلي الدقيق والكبير – وهذه تظهر خصائص معمارية خلوية مميزة²⁷. عادة ، يتميز التنكس الدهني الحويصلي الدقيق بوجود LDs صغيرة منتشرة في جميع أنحاء خلية الكبد مع وضع النواة مركزيا ، في حين يتميز التنكس الدهني الحويصلي الكبير بوجود LD كبير واحد يحتل الجزء الأكبر من خلية الكبد ، مما يدفع النواة إلى المحيط^28,29. والجدير بالذكر أن هذين النوعين من التنكس الدهني غالبا ما يتم العثور عليهما معا ، ولا يزال من غير الواضح كيف يؤثر هذان النمطان من LD على التسبب في المرض ، حيث لا تزال الأدلة غير متسقة³¹،³²،^33،34. ومع ذلك ، غالبا ما يستخدم هذا النوع من التحليل ك “معيار مرجعي” في الدراسات قبل السريرية والسريرية لفهم السلوك الديناميكي ل LDs وتوصيف التنكس الدهني الكبدي²⁹،³⁴،^35،36.

يتم تقييم خزعات الكبد ، المعيار الذهبي لتشخيص وتصنيف HS ، بشكل روتيني عن طريق تحليل الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) النسيجي ، حيث يتم تقييم قطرات الدهون على أنها فجوات غير ملوثة في أقسام الكبد الملطخة H&E³⁷. في حين أنه مقبول لتقييم التنكس الدهني الحويصلي الكبير ، فإن هذا النوع من التلوين يضيق عموما تقييم التنكس الدهني الحويصلي^{الدقيق 38}. يتم دمج أصباغ ديازو القابلة للذوبان في الدهون ، مثل Oil Red O (ORO) ، بشكل كلاسيكي مع الفحص المجهري برايتفيلد لتحليل مخازن الدهون داخل الخلايا ، ولكن لا يزال لها عدد من العيوب: (i) استخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول في عملية التلوين ، والتي غالبا ما تسبب تعطيل LDs الأصلية والانصهار العرضي على الرغم من إصلاح الخلايا³⁹; (ii) الطبيعة المستهلكة للوقت ، حيث يتطلب محلول ORO إذابة مسحوق طازج وترشيحه بسبب مدة الصلاحية المحدودة ، مما يساهم في نتائج أقل اتساقا ؛ (iii) وحقيقة أن ORO يلطخ أكثر من مجرد قطرات دهنية وغالبا ما يبالغ في تقدير التنكس الدهني الكبدي³⁸.

وبالتالي ، تم استخدام الفلوروفورات المحبة للدهون المنفذة للخلايا ، مثل النيل الأحمر ، إما في عينات حية أو ثابتة للتغلب على بعض القيود المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لوضع العلامات على عضيات الدهون الخلوية تضيق مرارا وتكرارا تقييمات LD⁴⁰. علاوة على ذلك ، تختلف الخصائص الطيفية لأحمر النيل وفقا لقطبية البيئة ، والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى تحولات طيفية⁴¹.

مسبار الفلورسنت المحب للدهون 1،3،5،7،8-خماسي ميثيل-4-بورا-3a، 4adiaza-s-indacene (الطول الموجي للإثارة: 480 نانومتر ؛ الحد الأقصى للانبعاث: 515 نانومتر ؛ BODIPY 493/503) خصائص الكارهة للماء التي تسمح بامتصاصه السريع بواسطة LDs داخل الخلايا ، ويتراكم في قلب قطرات الدهون ، وبالتالي ينبعث منه مضان أخضر فاتح¹². على عكس النيل الأحمر ، فإن BODIPY 493/503 غير حساس لقطبية البيئة وقد ثبت أنه أكثر انتقائية ، لأنه يعرض سطوعا عاليا لتصوير LD. من أجل تلطيخ LDs المحايدة ، يمكن استخدام هذه الصبغة في الخلايا الحية أو الثابتة وتقترن بنجاح بطرق تلطيخ و / أو وضع العلامات الأخرى⁴². ميزة أخرى للصبغة هي أنها تتطلب القليل من الجهد لوضعها في محلول ومستقرة ، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى إعدادها حديثا لكل تجربة⁴². على الرغم من أن مسبار BODIPY 493/503 قد تم استخدامه بنجاح لتصور توطين وديناميكيات LDs في مزارع الخلايا ، فقد أظهرت بعض التقارير أيضا الاستخدام الموثوق لهذه الصبغة كأداة تصوير LD في الأنسجة بما في ذلك عضلة الأوعية الدموية البشرية⁴³ ، وعضلة الفئران الوحيدة 42 ، وأمعاء الفأر⁴⁴.

هنا ، نقترح بروتوكولا محسنا قائما على BODIPY 493/503 كنهج تحليلي بديل لتقييم رقم LD ومساحته وقطره في عينات الكبد من نموذج حيواني للتنكس الدهني الكبدي. يغطي هذا الإجراء تحضير عينة الكبد ، وتقسيم الأنسجة ، وظروف التلوين ، والحصول على الصور ، وتحليل البيانات.