Summary

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Published: June 02, 2023
doi:

Summary

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Abstract

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que median el almacenamiento de lípidos y desempeñan un papel muy importante en la supresión de la lipotoxicidad y la prevención de la disfunción causada por los ácidos grasos libres (FA). El hígado, dado su papel crítico en el metabolismo de las grasas del cuerpo, está persistentemente amenazado por la acumulación intracelular de LD en forma de esteatosis hepática microvesicular y macrovesicular. La caracterización histológica de los LD se basa típicamente en colorantes diazo solubles en lípidos, como la tinción Oil Red O (ORO), pero una serie de desventajas dificultan consistentemente el uso de este análisis con muestras de hígado. Más recientemente, los fluoróforos lipofílicos 493/503 se han vuelto populares para visualizar y localizar LD debido a su rápida absorción y acumulación en el núcleo de gotas de lípidos neutros. Aunque la mayoría de las aplicaciones están bien descritas en cultivos celulares, hay menos evidencia que demuestre el uso confiable de sondas de fluoróforos lipofílicos como una herramienta de imagen LD en muestras de tejido. En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en diprometeno de boro (BODIPY) 493/503 para la evaluación de LD en muestras de hígado de un modelo animal de esteatosis hepática inducida por dieta alta en grasas (HFD). Este protocolo cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, la tinción BODIPY 493/503, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Demostramos un aumento del número, la intensidad, la relación de área y el diámetro de LD hepáticas al alimentarse con HFD. Usando proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar el contenido completo de lípidos neutros en el núcleo LD, que aparecieron como gotitas casi esféricas. Además, con el fluoróforo BODIPY 493/503, pudimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermedias (3 μm 9 μm), permitiendo la discriminación exitosa de esteatosis microvesicular y macrovesicular. En general, este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 es una herramienta fiable y sencilla para la caracterización hepática de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos.

Introduction

Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos 1,2,3.

La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones, pero se unen en lentes de aceite que crecen y brotan en gotitas casi esféricas de la membrana ER cuando su concentración intracelular aumenta4. Posteriormente, las proteínas de la bicapa ER y el citosol, particularmente la familia de proteínas perilipina (PLIN), se translocan a las superficies de las LD para facilitar la gemación 5,6,7,8,9.

A través de la síntesis de nuevos ácidos grasos y la fusión o coalescencia de LD, los LD crecen en diferentes tamaños. En consecuencia, el tamaño y el número de LD difieren considerablemente entre los diferentes tipos de células. Las pequeñas gotas (300-800 nm de diámetro), que se conocen como LD iniciales (iLDs), pueden ser formadas por casi todas las células4. Más adelante en la formación de LD, la mayoría de las células son capaces de convertir algunos iLD en LD más grandes que se expanden (eLD >1 μm de diámetro). Sin embargo, solo tipos celulares específicos, como los adipocitos y los hepatocitos, tienen la capacidad de formar LD gigantes o de gran tamaño (hasta decenas de micras de diámetro)4,10.

Las LD juegan un papel muy importante en la regulación del metabolismo lipídico celular, suprimiendo la lipotoxicidad y previniendo el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y, en última instancia, la muerte celular causada por ácidos grasos libres (AF)11,12,13,14. Además, las LD también han sido implicadas en la regulación de la expresión génica, el secuestro de proteínas de replicación viral y el tráfico y señalización de membranas15,16,17. Por lo tanto, la mala regulación de la biogénesis de LD es un sello distintivo de las enfermedades crónicas asociadas con el síndrome metabólico, la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y / o la arteriosclerosis, por nombrar solo algunas 18,19,20.

El hígado, como centro metabólico, es el principal responsable del metabolismo de los lípidos mediante el almacenamiento y procesamiento de lípidos, y, por lo tanto, está constantemente amenazado por la lipotoxicidad21. La esteatosis hepática (HS) es una característica común de una serie de enfermedades hepáticas progresivas y se caracteriza por una acumulación excesiva de lípidos intracelulares en forma de LD citosólicas que, en última instancia, pueden conducir a disfunción metabólica hepática, inflamación y formas avanzadas de enfermedad del hígado graso no alcohólico22,23,24,25. La HS ocurre cuando la tasa de oxidación de ácidos grasos y exportación como triglicéridos dentro de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) es menor que la tasa de absorción de ácidos grasos hepáticos de la síntesis plasmática y de novo de ácidos grasos26. La acumulación hepática de lípidos ocurre a menudo en dos formas, esteatosis microvesicular y macrovesicular, y éstas presentan características citoarquitectónicas distintas27. Típicamente, la esteatosis microvesicular se caracteriza por la presencia de pequeñas LDs dispersas por todo el hepatocito con el núcleo colocado centralmente, mientras que la esteatosis macrovesicular se caracteriza por la presencia de una sola LD grande que ocupa la mayor parte del hepatocito, empujando el núcleo hacia la periferia28,29. En particular, estos dos tipos de esteatosis a menudo se encuentran juntos, y no está claro cómo estos dos patrones de LD influyen en la patogénesis de la enfermedad, ya que la evidencia aún es inconsistente31,32,33,34. Sin embargo, ese tipo de análisis se emplea a menudo como un “estándar de referencia” en estudios preclínicos y clínicos para comprender el comportamiento dinámico de los LD y caracterizar la esteatosis hepática 29,34,35,36.

Las biopsias hepáticas, el estándar de oro para diagnosticar y clasificar la HS, se evalúan rutinariamente mediante análisis histológico de hematoxilina y eosina (H&E), donde las gotitas de lípidos se evalúan como vacuolas no teñidas en secciones hepáticas teñidas con H&E37. Aunque aceptable para la evaluación de la esteatosis macrovesicular, este tipo de tinción generalmente estrecha la evaluación de la esteatosis microvesicular38. Los colorantes diazosolubles en lípidos, como Oil Red O (ORO), se combinan clásicamente con microscopía de campo claro para analizar las reservas de lípidos intracelulares, pero todavía tienen una serie de desventajas: (i) el uso de etanol o isopropanol en el proceso de tinción, que a menudo causa la interrupción de los LD nativos y la fusión ocasional a pesar de que las células están fijadas39; ii) el carácter lento, ya que la solución ORO requiere la disolución y el filtrado del polvo fresco debido a la vida útil limitada, lo que contribuye a resultados menos consistentes; (iii) y el hecho de que ORO tiñe más que solo gotas lipídicas y a menudo sobreestima la esteatosis hepática38.

En consecuencia, los fluoróforos lipofílicos permeables a las células, como el rojo del Nilo, se han utilizado en muestras vivas o fijas para superar algunas de las limitaciones antes mencionadas. Sin embargo, la naturaleza no específica del etiquetado de orgánulos lipídicos celulares reduce repetidamente las evaluaciones de LD40. Además, las propiedades espectrales del Rojo del Nilo varían según la polaridad del medio ambiente, lo que a menudo puede conducir a cambios espectrales41.

La sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (longitud de onda de excitación: 480 nm; emisión máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibe características de hidrofobicidad que permiten su rápida absorción por LD intracelular, se acumula en el núcleo de gotas lipídicas y, posteriormente, emite fluorescencia verde brillante12. A diferencia del Nile Red, BODIPY 493/503 es insensible a la polaridad del entorno y se ha demostrado que es más selectivo, ya que muestra un alto brillo para imágenes LD. Para teñir LDs neutros, este colorante puede ser utilizado en células vivas o fijas y acoplado con éxito con otros métodos de tinción y/o etiquetado42. Otra ventaja del tinte es que requiere poco esfuerzo para colocarlo en una solución y es estable, eliminando así la necesidad de prepararlo recién para cada experimento42. A pesar de que la sonda BODIPY 493/503 se ha empleado con éxito para visualizar la localización y la dinámica de LD en cultivos celulares, algunos informes también han demostrado el uso confiable de este colorante como una herramienta de imagen LD en tejidos, incluido el músculo vasto lateral humano43, el músculo sóleo de rata42 y el intestino de ratón44.

En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en BODIPY 493/503 como un enfoque analítico alternativo para la evaluación del número, área y diámetro de LD en muestras hepáticas de un modelo animal de esteatosis hepática. Este procedimiento cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, las condiciones de tinción, la adquisición de imágenes y el análisis de datos.

Protocol

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Instituto Coimbra de Investigación Clínica y Biomédica (iCBR) Organismo de Bienestar Animal (ORBEA, # 9 / 2018) y cumplieron con las Directivas Nacionales y Europeas de Cuidado de Animales y con las directrices ARRIVE. 1. Diseño experimental Parejas de ratas Wistar macho de 13 semanas de edad en jaulas ventiladas en condiciones ambientales controladas de temperatura (22 °C ?…

Representative Results

La ejecución exitosa de esta técnica debe resultar en una tinción clara de gotas lipídicas para la caracterización simultánea de la morfología LD (forma y densidad del núcleo lipídico basada en la reconstrucción 3D) junto con su distribución espacial, número por área total y tamaño promedio (evaluado con la tubería descrita anteriormente, Figura 1). <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload…

Discussion

Este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la evaluación de LD tuvo como objetivo desarrollar un nuevo enfoque de imagen para la evaluación de la esteatosis hepática. Dada la fuerte correlación entre la obesidad y la enfermedad del hígado graso, se utilizó la dieta alta en grasas al estilo occidental para establecer un modelo animal de esteatosis hepática26. Un aumento robusto en el contenido de TG hepática fue confirmado por un kit de ensayo colorimétrico cuantitativo de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada por fondos nacionales y europeos a través de la Fundación Portuguesa de Ciencia y Tecnología (FCT), el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y el Programa Operacional Factores de Competitividad (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) y POCI-01-0145-FEDER-007440. Los autores desean agradecer el apoyo de iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, una instalación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Coimbra y miembro de la infraestructura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de Bioimagen (POCI-01-0145-FEDER-022122), así como el apoyo de FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)
Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade
Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm
cutting edge
Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

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Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

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