ניתוח טיפות שומנים מוכתמות פלואורסצנטיות עם שחזור תלת ממדי להערכת סטאטוזיס בכבד

טיפות ליפידים (LDs), הנתפסות באופן קלאסי כמחסני אנרגיה, הן אברונים תאיים מיוחדים המתווכים אחסון שומנים, והן מהוות ליבת שומנים הידרופובית ניטרלית, המכילה בעיקר אסטרי כולסטרול וטריגליצרידים (TGs), עטופים בשכבה אחת פוספוליפידית ^1,2,3.

ביוגנזה של LD מתרחשת ברשתית האנדופלסמית (ER), החל בסינתזה של טריאצילגליצרול (TAG) ואסטרי סטרול. שומנים ניטרליים מפוזרים בין העלעלים של השכבה הדו-שכבתית של חדר המיון בריכוזים נמוכים, אך מתמזגים לעדשות שמן שגדלות ונובטות לטיפות כמעט כדוריות מממברנת המיון כאשר הריכוז התוך-תאי שלהם עולה⁴. לאחר מכן, חלבונים מדו-שכבתיים של ER וציטוזול, במיוחד ממשפחת החלבונים פריליפין (PLIN), עוברים טרנסלוקציה לפני השטח של LDs כדי להקל על ניצנים 5,6,7,8,9.

באמצעות סינתזת חומצות שומן חדשות ואיחוי LD או התמזגות, LDs גדלים לגדלים שונים. בהתאם לכך, הגודל והמספר של LDs שונים במידה ניכרת בין סוגי תאים שונים. טיפות קטנות (בקוטר 300-800 ננומטר), הידועות בשם LDs ראשוניים (iLDs), יכולות להיווצר כמעט על ידי כל התאים⁴. מאוחר יותר בהיווצרות LD, רוב התאים מסוגלים להמיר iLDs מסוימים ל- LDs גדולים יותר המרחיבים (eLDs בקוטר >1 מיקרומטר). עם זאת, רק סוגי תאים ספציפיים, כגון אדיפוציטים והפטוציטים, יש את היכולת ליצור LDs ענקיים או גדולים (עד עשרות מיקרון קוטר)^4,10.

LDs ממלאים תפקיד חשוב מאוד בוויסות חילוף החומרים של שומנים בתאים, דיכוי ליפוטוקסיות ומניעת לחץ בחדר המיון, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, ובסופו של דבר, מוות תאי הנגרם על ידי חומצות שומן חופשיות (FAs)^11,12,13,14. יתר על כן, LDs היו מעורבים גם בוויסות ביטוי גנים, שכפול נגיפים של חלבונים, וסחר בממברנות ואיתות^15,16,17. לכן, הרגולציה השגויה של ביוגנזה LD היא סימן היכר של מחלות כרוניות הקשורות לתסמונת מטבולית, השמנת יתר, סוכרת מסוג 2 (T2DM) ו / או טרשת עורקים, אם להזכיר רק כמה 18,19,20.

הכבד, כמרכז מטבולי, אחראי בעיקר על חילוף החומרים של שומנים על ידי אחסון ועיבוד שומנים, ולכן, הוא מאוים כל הזמן על ידי lipotoxicity²¹. סטאטוזיס בכבד (HS) הוא מאפיין נפוץ של סדרה של מחלות כבד מתקדמות ומאופיין בהצטברות שומנים תוך-תאית מוגזמת בצורה של LDs ציטוסוליים, שבסופו של דבר עלולים להוביל לתפקוד מטבולי לקוי של הכבד, דלקת וצורות מתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי^22,23,24,25. HS מתרחש כאשר קצב החמצון והייצוא של חומצות שומן כטריגליצרידים בתוך ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDLs) נמוך מקצב ספיגת חומצות השומן בכבד מהפלזמה ומסינתזת חומצות השומן דה נובו ²⁶. הצטברות הכבד של שומנים מתרחשת לעתים קרובות בשתי צורות – סטאטוזיס microvesicular ו macrovesicular – ואלה מציגים מאפיינים cytoarchitectonic מובהקים²⁷. בדרך כלל, סטאטוזיס microvesicular מאופיין על ידי נוכחות של LDs קטנים מפוזרים ברחבי hepatocyte עם הגרעין ממוקם במרכז, ואילו סטאטוזיס macrovesicular מאופיין על ידי נוכחות של LD גדול אחד שתופס את החלק הגדול של hepatocyte, דוחף את הגרעין לפריפריה^28,29. יש לציין כי שני סוגים אלה של סטאטוזיס נמצאים לעתים קרובות יחד, ועדיין לא ברור כיצד שני דפוסי LD אלה משפיעים על פתוגנזה של מחלות, שכן הראיות עדיין אינן עקביות ^31,32,33,34. עם זאת, סוג כזה של ניתוח משמש לעתים קרובות כ”תקן ייחוס” במחקרים פרה-קליניים וקליניים כדי להבין את ההתנהגות הדינמית של LDs ולאפיין סטאטוזיס בכבד 29,34,35,36.

ביופסיות כבד, תקן הזהב לאבחון ודירוג HS, מוערכות באופן שגרתי על ידי ניתוח היסטולוגי של המטוקסילין ואאוזין (H&E), שבו טיפות שומנים מוערכות כוואקולים לא מוכתמים במקטעי כבד מוכתמים H&E³⁷. בעוד מקובל עבור הערכת סטאטוזיס macrovesicular, סוג זה של מכתים בדרך כלל מצמצם את ההערכה של סטאטוזיס microvesicular³⁸. צבעי דיאזו מסיסים בשומנים, כגון Oil Red O (ORO), משולבים באופן קלאסי עם מיקרוסקופ brightfield כדי לנתח מאגרי שומנים תוך תאיים, אך עדיין יש להם מספר חסרונות: (i) השימוש באתנול או איזופרופנול בתהליך הצביעה, אשר לעתים קרובות גורם לשיבוש של LDs המקוריים ואיחוי מדי פעם למרות שהתאים קבועים³⁹; (ii) האופי הגוזל זמן, שכן פתרון ORO דורש המסה וסינון של אבקה טרייה בשל חיי המדף המוגבלים, ובכך תורם לתוצאות פחות עקביות; (iii) והעובדה כי ORO מכתים יותר מאשר רק טיפות שומנים ולעתים קרובות מעריך יתר על המידה סטאטוזיס^{בכבד 38}.

כתוצאה מכך, פלואורופורים ליפופיליים חדירים לתאים, כגון אדום הנילוס, שימשו בדגימות חיות או קבועות כדי להתגבר על חלק מהמגבלות שהוזכרו לעיל. עם זאת, האופי הלא ספציפי של תיוג אברוני שומנים בתאים מצמצם שוב ושוב את הערכות LD⁴⁰. יתר על כן, התכונות הספקטרליות של אדום הנילוס משתנות בהתאם לקוטביות הסביבה, מה שלעתים קרובות יכול להוביל לשינויים ספקטרליים⁴¹.

הגשושית הפלואורסצנטית הליפופילית 1,3,5,7,8-פנטמתיל-4-בורה-3a,4adiaza-s-indacene (אורך גל עירור: 480 ננומטר; פליטה מרבית: 515 ננומטר; BODIPY 493/503) מציג מאפיינים הידרופוביים המאפשרים ספיגה מהירה שלו על ידי LDs תוך תאי, מצטבר בליבת טיפת השומנים, ולאחר מכן, פולט פלואורסצנטיות ירוקה בהירה¹². שלא כמו אדום הנילוס, BODIPY 493/503 אינו רגיש לקוטביות הסביבה והוכח כסלקטיבי יותר, מכיוון שהוא מציג בהירות גבוהה עבור הדמיית LD. על מנת להכתים LDs ניטרליים, ניתן להשתמש בצבע זה בתאים חיים או קבועים ולשלב בהצלחה עם שיטות צביעה ו / או תיוג אחרות⁴². יתרון נוסף של הצבע הוא שהוא דורש מאמץ מועט כדי להכניס לתמיסה והוא יציב, ובכך מבטל את הצורך להכין אותו טרי לכל ניסוי⁴². למרות שהגשושית BODIPY 493/503 שימשה בהצלחה כדי להמחיש את הלוקליזציה והדינמיקה של LDs בתרביות תאים, דיווחים מסוימים הדגימו גם את השימוש האמין בצבע זה ככלי הדמיה LD ברקמות, כולל שריר vastus lateralis⁴³ האנושי, שריר סוליאוס^{חולדה 42} ומעי עכבר⁴⁴.

בזאת, אנו מציעים פרוטוקול מותאם מבוסס BODIPY 493/503 כגישה אנליטית חלופית להערכת מספר, שטח וקוטר LD בדגימות כבד ממודל בעלי חיים של סטאטוזיס כבד. הליך זה מכסה הכנת דגימות כבד, חתך רקמות, תנאי צביעה, רכישת תמונה וניתוח נתונים.