Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Klasik olarak enerji depoları olarak görülen lipit damlacıkları (LD’ler), lipit depolanmasına aracılık eden özel hücresel organellerdir ve esas olarak bir fosfolipid monokatmanı ^1,2,3 tarafından kapsüllenen kolesterol esterleri ve trigliseritler (TG’ler) içeren hidrofobik nötr bir lipit çekirdeği içerirler.

LD biyogenezi, triasilgliserol (TAG) ve sterol esterlerinin sentezi ile başlayan endoplazmik retikulumda (ER) meydana gelir. Nötr lipitler, düşük konsantrasyonlarda ER çift katmanlı broşürler arasında dağılır, ancak hücre içi konsantrasyonları⁴ arttığında ER membranından neredeyse küresel damlacıklar halinde büyüyen ve tomurcuklanan yağ lenslerine birleşir. Daha sonra, ER çift katmanlı ve sitosolden proteinler, özellikle perilipin (PLIN) protein ailesi, tomurcuklanmayı kolaylaştırmak için LD’lerin yüzeylerine translokasyon yapar 5,6,7,8,9.

Yeni yağ asidi sentezi ve LD füzyonu veya birleşmesi yoluyla, LD’ler farklı boyutlarda büyür. Buna göre, LD’lerin boyutu ve sayısı farklı hücre tipleri arasında önemli ölçüde farklılık gösterir. İlk LD’ler (iLD’ler) olarak bilinen küçük damlacıklar (300-800 nm çapında), neredeyse tüm hücreler tarafından oluşturulabilir⁴. LD oluşumunda daha sonra, çoğu hücre bazı iLD’leri daha büyük olanları genişleten LD’lere (eLD’ler >1 μm çapında) dönüştürebilir. Bununla birlikte, adipositler ve hepatositler gibi sadece spesifik hücre tipleri, dev veya süper boyutlu LD’ler (onlarca mikron çapına kadar) oluşturma kapasitesine ^sahiptir4,10.

LD’ler, hücresel lipit metabolizmasının düzenlenmesinde, lipotoksisitenin baskılanmasında ve ER stresinin, mitokondriyal disfonksiyonun ve nihayetinde serbest yağ asitlerinin (FA’lar) neden olduğu hücre ölümünün önlenmesinde çok önemli bir rol oynamaktadır11,12,13,14. Ayrıca, LD’ler ayrıca gen ekspresyonunun, viral replikasyon proteini tutulmasının ve membran kaçakçılığının ve sinyalizasyonunun düzenlenmesinde de rol oynamıştır^15,16,17. Bu nedenle, LD biyogenezinin yanlış düzenlenmesi, metabolik sendrom, obezite, tip 2 diabetes mellitus (T2DM) ve / veya arteriyoskleroz ile ilişkili kronik hastalıkların bir ^işaretidir.

Karaciğer, metabolik bir merkez olarak, lipitleri depolayarak ve işleyerek lipit metabolizmasından çoğunlukla sorumludur ve bu nedenle, lipotoksisite²¹ tarafından sürekli tehdit edilmektedir. Hepatik steatoz (HS), bir dizi ilerleyici karaciğer hastalığının ortak bir özelliğidir ve sonuçta karaciğer metabolik disfonksiyonuna, inflamasyona ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının ileri formlarına yol açabilen sitozolik LD’ler şeklinde aşırı hücre içi lipid birikimi ile karakterizedir^22,23,24,25. HS, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL’ler) içindeki yağ asidi oksidasyonu ve trigliseritler olarak ihracat hızı, plazmadan hepatik yağ asidi alım hızından ve de novo yağ asidi sentezinden²⁶ daha düşük olduğunda ortaya çıkar. Lipidlerin hepatik birikimi sıklıkla iki formda ortaya çıkar – mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz- ve bunlar farklı sitoarkitektonik özellikler gösterir²⁷. Tipik olarak, mikro-veziküler steatoz, çekirdeğin merkezi olarak yerleştirildiği hepatosit boyunca dağılmış küçük LD’lerin varlığı ile karakterize edilirken, makroveziküler steatoz, hepatositin büyük bölümünü kaplayan ve çekirdeği çevreye iten tek bir büyük LD’nin varlığı ile karakterize edilir^28,29. Özellikle, bu iki tip steatoz sıklıkla birlikte bulunur ve bu iki LD paterninin hastalık patogenezini nasıl etkilediği belirsizliğini korumaktadır, çünkü kanıtlar hala tutarsızdır^31,32,33,34. Bununla birlikte, bu tür analizler genellikle LD’lerin dinamik davranışını anlamak ve hepatik steatozu^karakterize etmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda bir “referans standardı” olarak kullanılır 29,34,35,36.

HS tanısı ve derecelendirilmesinde altın standart olan karaciğer biyopsileri, H&E boyalı karaciğer bölümlerinde lipid damlacıklarının lekelenmemiş vakuoller olarak değerlendirildiği histolojik hematoksilin ve eozin (H&E) analizi ile rutin olarak değerlendirilmektedir³⁷. Makroveziküler steatoz değerlendirmesi için kabul edilebilir olsa da, bu tip boyama genellikle mikro-veziküler steatoz^38’in değerlendirmesini daraltır. Yağ Kırmızısı O (ORO) gibi lipitte çözünür diazo boyaları, hücre içi lipit depolarını analiz etmek için klasik olarak parlak alan mikroskobu ile birleştirilir, ancak bunların hala bir takım dezavantajları vardır: (i) boyama işleminde etanol veya izopropanol kullanımı, bu da genellikle doğal LD’lerin bozulmasına ve hücrelerin sabitlenmesine rağmen ara sıra füzyona neden olur³⁹; (ii) ORO çözeltisi, sınırlı raf ömrü nedeniyle taze tozun çözülmesini ve filtrelenmesini gerektirdiğinden, zaman alıcı doğa, böylece daha az tutarlı sonuçlara katkıda bulunur; (iii) ve ORO’nun sadece lipit damlacıklarından daha fazlasını boyadığı ve sıklıkla hepatik steatoz^38’i abarttığı gerçeği.

Sonuç olarak, Nil Kırmızısı gibi hücre geçirgen lipofilik floroforlar, yukarıda belirtilen sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için canlı veya sabit numunelerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücresel lipid organel etiketlemesinin spesifik olmayan doğası, LD değerlendirmelerini tekrar tekrar daraltır⁴⁰. Dahası, Nil Kırmızısı’nın spektral özellikleri, çevrenin polaritesine göre değişir ve bu da genellikle spektral kaymalara yol açabilir⁴¹.

Lipofilik floresan prob 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (uyarma dalga boyu: 480 nm; emisyon maksimum: 515 nm; BODIPY 493/503), hücre içi LD’ler tarafından hızlı bir şekilde alınmasına izin veren, lipit damlacık çekirdeğinde biriken ve daha sonra parlak yeşil floresan¹² yayan hidrofobiklik özellikleri sergiler. Nil Kırmızısı’nın aksine, BODIPY 493/503 çevre polaritesine duyarsızdır ve LD görüntüleme için yüksek parlaklık gösterdiği için daha seçici olduğu gösterilmiştir. Nötr LD’leri boyamak için, bu boya canlı veya sabit hücrelerde kullanılabilir ve diğer boyama ve / veya etiketleme yöntemleriyle başarıyla birleştirilebilir⁴². Boyanın bir diğer avantajı, bir çözeltiye yerleştirmek için çok az çaba gerektirmesi ve kararlı olmasıdır, böylece her deney için taze olarak hazırlama ihtiyacını ortadan kaldırır⁴². BODIPY 493/503 probu, hücre kültürlerinde LD’lerin lokalizasyonunu ve dinamiklerini görselleştirmek için başarıyla kullanılmış olsa da, bazı raporlar bu boyanın insan vastus lateralis kası⁴³, sıçan soleus kası 42 ve fare bağırsağı⁴⁴ dahil olmak üzere dokularda LD görüntüleme aracı olarak güvenilir bir şekilde kullanıldığını göstermiştir.

Burada, hepatik steatozun bir hayvan modelinden karaciğer örneklerinde LD sayısının, alanının ve çapının değerlendirilmesi için alternatif bir analitik yaklaşım olarak optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 tabanlı protokol öneriyoruz. Bu prosedür karaciğer örneği hazırlama, doku kesitleme, boyama koşulları, görüntü elde etme ve veri analizini kapsar.