Summary

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Published: June 02, 2023
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Summary

In dieser Arbeit demonstrieren wir ein optimiertes BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basiertes Protokoll zur Charakterisierung von Lipidtröpfchen in Lebergewebe. Durch die Verwendung von orthogonalen Projektionen und 3D-Rekonstruktionen ermöglicht der Fluorophor eine erfolgreiche Unterscheidung zwischen mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose und kann einen komplementären Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen zur Beurteilung der hepatischen Steatose darstellen.

Abstract

Lipidtröpfchen (LDs) sind spezialisierte Organellen, die die Lipidspeicherung vermitteln und eine sehr wichtige Rolle bei der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von Funktionsstörungen spielen, die durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht werden. Die Leber ist aufgrund ihrer entscheidenden Rolle im Fettstoffwechsel des Körpers ständig durch die intrazelluläre Anhäufung von LDs in Form von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Lebersteatose bedroht. Die histologische Charakterisierung von LDs basiert in der Regel auf lipidlöslichen Diazofarbstoffen, wie z. B. der Oil Red O (ORO)-Färbung, aber eine Reihe von Nachteilen erschweren die Verwendung dieser Analyse mit Leberproben durchweg. In jüngerer Zeit sind lipophile Fluorophore 493/503 aufgrund ihrer schnellen Aufnahme und Akkumulation in den neutralen Lipidtröpfchenkern für die Visualisierung und Lokalisierung von LDs populär geworden. Obwohl die meisten Anwendungen in Zellkulturen gut beschrieben sind, gibt es weniger Evidenz für den zuverlässigen Einsatz von lipophilen Fluorophorsonden als LD-Bildgebungswerkzeug in Gewebeproben. In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes Bordipyrromethen (BODIPY) 493/503 basiertes Protokoll für die Evaluierung von LDs in Leberproben aus einem Tiermodell der fettreichen Diät (HFD)-induzierten hepatischen Steatose vor. Dieses Protokoll umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die BODIPY 493/503-Färbung, die Bildaufnahme und die Datenanalyse. Wir zeigen eine erhöhte Anzahl, Intensität, Flächenzahl und Durchmesser von hepatischen LDs bei HFD-Ernährung. Mittels orthogonaler Projektionen und 3D-Rekonstruktionen war es möglich, den vollen Gehalt an neutralen Lipiden im LD-Kern zu beobachten, die als nahezu kugelförmige Tröpfchen auftraten. Darüber hinaus konnten wir mit dem Fluorophor BODIPY 493/503 Mikrovesikel (1 μm < d ≤ 3 μm), intermediäre Vesikel (3 μm 9 μm) unterscheiden, was eine erfolgreiche Unterscheidung von mikrovesikulärer und makrovesikulärer Steatose ermöglicht. Insgesamt ist dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll ein zuverlässiges und einfaches Werkzeug für die hepatische LD-Charakterisierung und könnte einen ergänzenden Ansatz zu den klassischen histologischen Protokollen darstellen.

Introduction

Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ist 1,2,3.

Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segeln der ER-Doppelschicht, verschmelzen aber zu Öllinsen, die wachsen und zu fast kugelförmigen Tröpfchen aus der ER-Membran austreiben, wenn ihre intrazelluläre Konzentration steigt4. Anschließend translozieren Proteine aus der ER-Doppelschicht und dem Zytosol, insbesondere die Perilipin (PLIN)-Proteinfamilie, auf die Oberflächen der LDs, um die Knospung zu erleichtern 5,6,7,8,9.

Durch die Synthese neuer Fettsäuren und die Fusion oder Koaleszenz von LDs wachsen LDs in unterschiedliche Größen heran. Dementsprechend unterscheiden sich Größe und Anzahl der LDs zwischen den verschiedenen Zelltypen erheblich. Kleine Tröpfchen (300-800 nm Durchmesser), die als initiale LDs (iLDs) bezeichnet werden, können von fast allen Zellen gebildet werden4. Später in der LD-Bildung sind die meisten Zellen in der Lage, einige iLDs in größere, expandierende LDs (eLDs >1 μm Durchmesser) umzuwandeln. Doch nur bestimmte Zelltypen, wie Adipozyten und Hepatozyten, haben die Fähigkeit, riesige oder übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) zu bilden4,10.

LDs spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des zellulären Fettstoffwechsels, der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und letztendlich des Zelltods, der durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht wird11,12,13,14. Darüber hinaus sind LDs auch an der Regulation der Genexpression, der Sequestrierung von viralen Replikationsproteinen sowie des Membrantransports und der Signalübertragung beteiligt15,16,17. Daher ist die Fehlregulation der LD-Biogenese ein Kennzeichen chronischer Krankheiten, die mit metabolischem Syndrom, Adipositas, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und/oder Arteriosklerose, um nur einige zu nennen, assoziiert sind18,19,20.

Die Leber als Stoffwechselknotenpunkt ist hauptsächlich für den Fettstoffwechsel verantwortlich, indem sie Lipide speichert und verarbeitet, und ist daher ständig von Fettotoxizität bedroht21. Die hepatische Steatose (HS) ist ein häufiges Merkmal einer Reihe von fortschreitenden Lebererkrankungen und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Lipidakkumulation in Form von zytosolischen LDs, die letztendlich zu Stoffwechselstörungen der Leber, Entzündungen und fortgeschrittenen Formen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung führen können22,23,24,25. HS tritt auf, wenn die Rate der Fettsäureoxidation und des Exports als Triglyceride innerhalb von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDLs) niedriger ist als die Rate der hepatischen Fettsäureaufnahme aus dem Plasma und der de novo Fettsäuresynthese26. Die hepatische Akkumulation von Lipiden tritt häufig in zwei Formen auf – mikrovesikuläre und makrovesikuläre Steatose -, und diese weisen unterschiedliche zytoarchitektonische Merkmale auf27. Typischerweise ist die mikrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein kleiner LDs gekennzeichnet, die über die gesamte Hepatozyten verteilt sind und deren Kern zentral platziert ist, während die makrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein einer einzigen großen LD gekennzeichnet ist, die den größten Teil der Hepatozyten einnimmt und den Kern in die Peripherie drückt28,29. Bemerkenswert ist, dass diese beiden Arten der Steatose oft zusammen gefunden werden, und es bleibt unklar, wie diese beiden LD-Muster die Krankheitspathogenese beeinflussen, da die Evidenz immer noch uneinheitlich ist31,32,33,34. Diese Art der Analyse wird jedoch häufig als “Referenzstandard” in präklinischen und klinischen Studien verwendet, um das dynamische Verhalten von LDs zu verstehen und die hepatische Steatose zu charakterisieren 29,34,35,36.

Leberbiopsien, der Goldstandard für die Diagnose und Einstufung von HS, werden routinemäßig durch histologische Hämatoxylin- und Eosinanalysen (H&E) beurteilt, bei denen Lipidtröpfchen als ungefärbte Vakuolen in H&E-gefärbten Leberschnitten ausgewertet werden37. Diese Art der Färbung ist zwar für die Beurteilung der makrovesikulären Steatose akzeptabel, schränkt aber im Allgemeinen die Beurteilung der mikrovesikulären Steatoseein 38. Fettlösliche Diazofarbstoffe, wie z. B. Oil Red O (ORO), werden klassischerweise mit der Hellfeldmikroskopie kombiniert, um intrazelluläre Lipidspeicher zu analysieren, aber diese haben immer noch eine Reihe von Nachteilen: (i) die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol im Färbeprozess, was häufig zur Störung der nativen LDs und gelegentlich zur Fusion führt, obwohl die Zellen fixiert sind39; (ii) die zeitaufwändige Natur, da die ORO-Lösung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit frisches Pulver auflöst und filtriert, was zu weniger konsistenten Ergebnissen beiträgt; (iii) und die Tatsache, dass ORO mehr als nur Lipidtröpfchen färbt und die hepatische Steatose oft überschätzt38.

Folglich wurden zelldurchlässige lipophile Fluorophore, wie z. B. Nilrot, entweder in lebenden oder fixierten Proben verwendet, um einige der oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die unspezifische Natur der Markierung zellulärer Lipidorganellen schränkt die LD-Bewertungen jedoch immer wieder ein40. Darüber hinaus variieren die spektralen Eigenschaften von Nilrot je nach Polarität der Umgebung, was häufig zu spektralen Verschiebungen führen kann41.

Die lipophile Fluoreszenzsonde 1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (Anregungswellenlänge: 480 nm; Emissionsmaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) weist hydrophobe Eigenschaften auf, die eine schnelle Aufnahme durch intrazelluläre LDs ermöglichen, akkumuliert sich im Lipidtröpfchenkern und emittiert anschließend hellgrüne Fluoreszenz12. Im Gegensatz zu Nilrot ist BODIPY 493/503 unempfindlich gegenüber der Polarität der Umgebung und hat sich als selektiver erwiesen, da es eine hohe Helligkeit für die LD-Bildgebung aufweist. Um neutrale LDs zu färben, kann dieser Farbstoff in lebenden oder fixierten Zellen verwendet und erfolgreich mit anderen Färbe- und/oder Markierungsmethoden gekoppelt werden42. Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs besteht darin, dass er wenig Kraftaufwand erfordert, um ihn in eine Lösung zu geben, und stabil ist, so dass er nicht für jedes Experiment neu vorbereitet werden muss42. Obwohl die Sonde BODIPY 493/503 erfolgreich eingesetzt wurde, um die Lokalisation und Dynamik von LDs in Zellkulturen zu visualisieren, haben einige Berichte auch die zuverlässige Verwendung dieses Farbstoffs als LD-Bildgebungswerkzeug in Geweben wie dem menschlichen Musculus vastus lateralis43, dem Musculus soleus 42 der Ratte42 und dem Darmder Maus 44 gezeigt.

In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes BODIPY 493/503-basiertes Protokoll als alternativen analytischen Ansatz für die Bewertung der LD-Anzahl, -Fläche und des LD-Durchmessers in Leberproben aus einem Tiermodell der hepatischen Steatose vor. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die Färbebedingungen, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierversuche wurden von der Tierschutzbehörde des Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) (ORBEA, #9/2018) genehmigt und entsprachen den nationalen und europäischen Richtlinien für die Tierpflege sowie den ARRIVE-Richtlinien. 1. Versuchsplanung Paarhaltung von 13 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten in belüfteten Käfigen unter kontrollierten Umgebungsbedingungen von Temperatur (22 °C ± 1 °C), Luftf…

Representative Results

Die erfolgreiche Durchführung dieser Technik sollte zu einer eindeutigen Lipidtröpfchenfärbung für die gleichzeitige Charakterisierung der LD-Morphologie (Form und Lipidkerndichte basierend auf der 3D-Rekonstruktion) zusammen mit ihrer räumlichen Verteilung, Anzahl pro Gesamtfläche und durchschnittlicher Größe (bewertet mit der oben beschriebenen Pipeline, Abbildung 1) führen. <img alt="Figure 1" class="xfigimg" …

Discussion

Dieses BODIPY 493/503 Fluoreszenz-basierte Protokoll zur LD-Beurteilung zielte darauf ab, einen neuen Bildgebungsansatz für die Beurteilung der hepatischen Steatose zu entwickeln. Aufgrund des starken Zusammenhangs zwischen Adipositas und Fettlebererkrankungen wurde die fettreiche Diät nach westlichem Vorbild verwendet, um ein Tiermodell der Lebersteatose zu etablieren26. Ein robuster Anstieg der hepatischen TG-Gehalte wurde durch ein quantitatives kolorimetrisches Triglycerid-Assay-Kit bestäti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde aus nationalen und europäischen Mitteln über die portugiesische Wissenschafts- und Technologiestiftung (FCT), den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (FEDER) und das Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) finanziert: 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) und POCI-01-0145-FEDER-007440. Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung von iLAB – Microscopy and Bioimaging Lab, einer Einrichtung der Medizinischen Fakultät der Universität Coimbra und Mitglied der nationalen Infrastruktur PPBI-Portuguese Platform of BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), sowie für die Unterstützung von FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)
Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade
Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm
cutting edge
Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

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Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

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