Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Lipidtröpfchen (LDs), die klassischerweise als Energiedepots angesehen werden, sind spezialisierte Zellorganellen, die die Lipidspeicherung vermitteln, und sie bestehen aus einem hydrophoben neutralen Lipidkern, der hauptsächlich Cholesterinester und Triglyceride (TGs) enthält und von einer Phospholipid-Monoschicht eingekapselt ^{ist 1,2,3}.

Die LD-Biogenese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) statt, beginnend mit der Synthese von Triacylglycerin (TAG) und Sterolestern. Neutrale Lipide diffundieren in geringen Konzentrationen zwischen den Segeln der ER-Doppelschicht, verschmelzen aber zu Öllinsen, die wachsen und zu fast kugelförmigen Tröpfchen aus der ER-Membran austreiben, wenn ihre intrazelluläre Konzentration steigt⁴. Anschließend translozieren Proteine aus der ER-Doppelschicht und dem Zytosol, insbesondere die Perilipin (PLIN)-Proteinfamilie, auf die Oberflächen der LDs, um die Knospung zu erleichtern 5,6,7,8,9.

Durch die Synthese neuer Fettsäuren und die Fusion oder Koaleszenz von LDs wachsen LDs in unterschiedliche Größen heran. Dementsprechend unterscheiden sich Größe und Anzahl der LDs zwischen den verschiedenen Zelltypen erheblich. Kleine Tröpfchen (300-800 nm Durchmesser), die als initiale LDs (iLDs) bezeichnet werden, können von fast allen Zellen gebildet werden⁴. Später in der LD-Bildung sind die meisten Zellen in der Lage, einige iLDs in größere, expandierende LDs (eLDs >1 μm Durchmesser) umzuwandeln. Doch nur bestimmte Zelltypen, wie Adipozyten und Hepatozyten, haben die Fähigkeit, riesige oder übergroße LDs (bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser) zu ^bilden4,10.

LDs spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des zellulären Fettstoffwechsels, der Unterdrückung der Lipotoxizität und der Verhinderung von ER-Stress, mitochondrialer Dysfunktion und letztendlich des Zelltods, der durch freie Fettsäuren (FAs) verursacht wird11,12,13,14. Darüber hinaus sind LDs auch an der Regulation der Genexpression, der Sequestrierung von viralen Replikationsproteinen sowie des Membrantransports und der Signalübertragung beteiligt^15,16,17. Daher ist die Fehlregulation der LD-Biogenese ein Kennzeichen chronischer Krankheiten, die mit metabolischem Syndrom, Adipositas, Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) und/oder Arteriosklerose, um nur einige zu nennen, assoziiert sind^18,19,20.

Die Leber als Stoffwechselknotenpunkt ist hauptsächlich für den Fettstoffwechsel verantwortlich, indem sie Lipide speichert und verarbeitet, und ist daher ständig von Fettotoxizität bedroht²¹. Die hepatische Steatose (HS) ist ein häufiges Merkmal einer Reihe von fortschreitenden Lebererkrankungen und ist gekennzeichnet durch eine übermäßige intrazelluläre Lipidakkumulation in Form von zytosolischen LDs, die letztendlich zu Stoffwechselstörungen der Leber, Entzündungen und fortgeschrittenen Formen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung führen können^22,23,24,25. HS tritt auf, wenn die Rate der Fettsäureoxidation und des Exports als Triglyceride innerhalb von Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDLs) niedriger ist als die Rate der hepatischen Fettsäureaufnahme aus dem Plasma und der de novo Fettsäuresynthese²⁶. Die hepatische Akkumulation von Lipiden tritt häufig in zwei Formen auf – mikrovesikuläre und makrovesikuläre Steatose -, und diese weisen unterschiedliche zytoarchitektonische Merkmale auf²⁷. Typischerweise ist die mikrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein kleiner LDs gekennzeichnet, die über die gesamte Hepatozyten verteilt sind und deren Kern zentral platziert ist, während die makrovesikuläre Steatose durch das Vorhandensein einer einzigen großen LD gekennzeichnet ist, die den größten Teil der Hepatozyten einnimmt und den Kern in die Peripherie drückt^28,29. Bemerkenswert ist, dass diese beiden Arten der Steatose oft zusammen gefunden werden, und es bleibt unklar, wie diese beiden LD-Muster die Krankheitspathogenese beeinflussen, da die Evidenz immer noch uneinheitlich ist^31,32,33,34. Diese Art der Analyse wird jedoch häufig als “Referenzstandard” in präklinischen und klinischen Studien verwendet, um das dynamische Verhalten von LDs zu verstehen und die hepatische Steatose zu charakterisieren 29,34,35,36.

Leberbiopsien, der Goldstandard für die Diagnose und Einstufung von HS, werden routinemäßig durch histologische Hämatoxylin- und Eosinanalysen (H&E) beurteilt, bei denen Lipidtröpfchen als ungefärbte Vakuolen in H&E-gefärbten Leberschnitten ausgewertet werden³⁷. Diese Art der Färbung ist zwar für die Beurteilung der makrovesikulären Steatose akzeptabel, schränkt aber im Allgemeinen die Beurteilung der mikrovesikulären Steatose^{ein 38}. Fettlösliche Diazofarbstoffe, wie z. B. Oil Red O (ORO), werden klassischerweise mit der Hellfeldmikroskopie kombiniert, um intrazelluläre Lipidspeicher zu analysieren, aber diese haben immer noch eine Reihe von Nachteilen: (i) die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol im Färbeprozess, was häufig zur Störung der nativen LDs und gelegentlich zur Fusion führt, obwohl die Zellen fixiert sind³⁹; (ii) die zeitaufwändige Natur, da die ORO-Lösung aufgrund der begrenzten Haltbarkeit frisches Pulver auflöst und filtriert, was zu weniger konsistenten Ergebnissen beiträgt; (iii) und die Tatsache, dass ORO mehr als nur Lipidtröpfchen färbt und die hepatische Steatose oft überschätzt³⁸.

Folglich wurden zelldurchlässige lipophile Fluorophore, wie z. B. Nilrot, entweder in lebenden oder fixierten Proben verwendet, um einige der oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Die unspezifische Natur der Markierung zellulärer Lipidorganellen schränkt die LD-Bewertungen jedoch immer wieder ein⁴⁰. Darüber hinaus variieren die spektralen Eigenschaften von Nilrot je nach Polarität der Umgebung, was häufig zu spektralen Verschiebungen führen kann⁴¹.

Die lipophile Fluoreszenzsonde 1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (Anregungswellenlänge: 480 nm; Emissionsmaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) weist hydrophobe Eigenschaften auf, die eine schnelle Aufnahme durch intrazelluläre LDs ermöglichen, akkumuliert sich im Lipidtröpfchenkern und emittiert anschließend hellgrüne Fluoreszenz¹². Im Gegensatz zu Nilrot ist BODIPY 493/503 unempfindlich gegenüber der Polarität der Umgebung und hat sich als selektiver erwiesen, da es eine hohe Helligkeit für die LD-Bildgebung aufweist. Um neutrale LDs zu färben, kann dieser Farbstoff in lebenden oder fixierten Zellen verwendet und erfolgreich mit anderen Färbe- und/oder Markierungsmethoden gekoppelt werden⁴². Ein weiterer Vorteil des Farbstoffs besteht darin, dass er wenig Kraftaufwand erfordert, um ihn in eine Lösung zu geben, und stabil ist, so dass er nicht für jedes Experiment neu vorbereitet werden muss⁴². Obwohl die Sonde BODIPY 493/503 erfolgreich eingesetzt wurde, um die Lokalisation und Dynamik von LDs in Zellkulturen zu visualisieren, haben einige Berichte auch die zuverlässige Verwendung dieses Farbstoffs als LD-Bildgebungswerkzeug in Geweben wie dem menschlichen Musculus vastus lateralis⁴³, dem Musculus soleus 42 der Ratte⁴² und dem Darm^{der Maus 44} gezeigt.

In dieser Arbeit schlagen wir ein optimiertes BODIPY 493/503-basiertes Protokoll als alternativen analytischen Ansatz für die Bewertung der LD-Anzahl, -Fläche und des LD-Durchmessers in Leberproben aus einem Tiermodell der hepatischen Steatose vor. Dieses Verfahren umfasst die Vorbereitung von Leberproben, die Gewebeschnitte, die Färbebedingungen, die Bildaufnahme und die Datenanalyse.