Summary

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

Published: June 02, 2023
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Summary

ここでは、肝臓組織における脂肪滴の特性評価に最適化されたBODIPY 493/503蛍光ベースのプロトコルを示します。直交投影と3D再構成を使用することにより、蛍光色素は微小小胞性脂肪症と大水疱性脂肪症の識別に成功し、肝脂肪症評価のための古典的な組織学的プロトコルへの補完的なアプローチを表す可能性があります。

Abstract

脂肪滴(LD)は、脂質貯蔵を媒介する特殊な細胞小器官であり、脂肪毒性の抑制や遊離脂肪酸(FA)による機能障害の予防に非常に重要な役割を果たしています。肝臓は、体の脂肪代謝におけるその重要な役割を考えると、小胞性および大小胞性肝脂肪症の両方の形でのLDの細胞内蓄積によって持続的に脅かされています。LDの組織学的特性評価は、通常、オイルレッドO(ORO)染色などの脂溶性ジアゾ色素に基づいていますが、多くの欠点が肝臓標本でのこの分析の使用を一貫して妨げています。最近では、親油性蛍光色素493/503は、中性脂肪滴コアへの迅速な取り込みと蓄積により、LDの可視化と位置特定に一般的になっています。ほとんどのアプリケーションは細胞培養で十分に説明されていますが、組織サンプルにおけるLDイメージングツールとしての親油性蛍光色素プローブの信頼性の高い使用を実証する証拠はほとんどありません。ここでは、最適化されたホウ素ジピロメテン(BODIPY)493/503ベースのプロトコルを提案します 高脂肪食(HFD)誘発肝脂肪症の動物モデルからの肝臓検体中のLDの評価。このプロトコルは、肝臓サンプル調製、組織切片作成、BODIPY 493/503染色、画像取得、およびデータ分析をカバーしています。HFD給餌時の肝LDの数、強度、面積比、および直径の増加を示しています。直交投影と3D再構成を使用して、ほぼ球形の液滴として現れるLDコアの中性脂質の完全な含有量を観察することができました。さらに、蛍光色素BODIPY 493/503では、マイクロベシクル(1 μm < d ≤ 3 μm)、中間小胞(3 μm 9 μm)を区別することができ、微小小胞および大小胞脂肪症の識別に成功しました。全体として、このBODIPY 493/503蛍光ベースのプロトコルは、肝臓LDの特性評価のための信頼性が高くシンプルなツールであり、古典的な組織学的プロトコルに対する補完的なアプローチを表す可能性があります。

Introduction

古典的にエネルギー貯蔵庫と見なされる脂肪滴(LD)は、脂質貯蔵を媒介する特殊な細胞小器官であり、リン脂質単層1,2,3によってカプセル化されたコレステロールエステルおよびトリグリセリド(TG)を主成分とする疎水性の中性脂質コアを含む。

LD生合成は、トリアシルグリセロール(TAG)およびステロールエステルの合成から始めて、小胞体(ER)で起こる。中性脂質は、低濃度では小胞体二重層の小葉の間に拡散しますが、細胞内濃度が増加すると、小胞体膜からほぼ球形の液滴に成長して発芽する油レンズに合体します4。続いて、ER二重層およびサイトゾルからのタンパク質、特にペリリピン(PLIN)タンパク質ファミリーがLDの表面に移行し、出芽を促進します56789

新しい脂肪酸合成とLD融合または合体により、LDはさまざまなサイズに成長します。したがって、LDのサイズと数は、細胞タイプによって大きく異なります。初期LD(iLD)として知られる小さな液滴(直径300〜800 nm)は、ほぼすべての細胞によって形成され得る4。LD形成の後半では、ほとんどの細胞はいくつかのiLDをより大きなiLDに変換することができます-より大きな拡張LD(直径>1μmのeLD)。しかし、脂肪細胞や肝細胞などの特定の細胞型だけが、巨大または超大型のLD(直径数十ミクロンまで)を形成する能力を持っています4,10

LDは、細胞の脂質代謝の調節、脂肪毒性の抑制、小胞体ストレス、ミトコンドリア機能障害、そして最終的には遊離脂肪酸(FA)によって引き起こされる細胞死の予防に非常に重要な役割を果たします11,12,13,14。さらに、LDは、遺伝子発現、ウイルス複製タンパク質隔離、および膜輸送およびシグナル伝達の調節にも関与しています15,16,17。したがって、LD生合成の誤調節は、メタボリックシンドローム、肥満、2型糖尿病(T2DM)、および/または動脈硬化に関連する慢性疾患の特徴であり、ほんの数例を挙げると18,19,20です。

肝臓は、代謝ハブとして、脂質を貯蔵および処理することによって脂質代謝に主に関与しているため、脂肪毒性によって常に脅かされています21。肝脂肪症(HS)は、一連の進行性肝疾患の一般的な特徴であり、細胞質LDの形での過剰な細胞内脂質蓄積を特徴とし、最終的には肝代謝機能障害、炎症、および進行型の非アルコール性脂肪性肝疾患につながる可能性があります22,23,24,25.HSは、超低密度リポタンパク質(VLDL)内の脂肪酸の酸化およびトリグリセリドとしての輸出の速度が、血漿およびde novo脂肪酸合成からの肝脂肪酸の取り込み速度よりも低い場合に発生します26。脂質の肝蓄積は、しばしば2つの形態(微小小胞および大小胞脂肪症)で起こり、これらは明確な細胞アーキテクト学的特徴を示す27。典型的には、微小小胞脂肪症は、核が中央に配置された肝細胞全体に分散した小さなLDの存在によって特徴付けられるのに対し、大小胞脂肪症は、肝細胞の大部分を占める単一の大きなLDの存在によって特徴付けられ、核を末梢に押し出す28,29。.特に、これら2種類の脂肪症はしばしば一緒に発見され、証拠がまだ一貫していないため、これら2つのLDパターンが疾患の病因にどのように影響するかは不明のままです31,32,33,34。しかし、このようなタイプの分析は、LDの動的挙動を理解し、肝脂肪症を特徴付けるための前臨床および臨床試験の「参照標準」としてしばしば採用されます29,34,35,36。

HSの診断と等級付けのゴールドスタンダードである肝生検は、組織学的ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)分析によって日常的に評価され、脂肪滴はH&E染色された肝臓切片の染色されていない液胞として評価されます37。大水疱性脂肪症の評価には許容できるが、このタイプの染色は一般に微小小胞脂肪症の評価を狭める38。Oil Red O(ORO)などの脂溶性ジアゾ色素は、細胞内脂質貯蔵を分析するために古典的に明視野顕微鏡と組み合わされますが、これらには依然として多くの欠点があります:(i)染色プロセスでのエタノールまたはイソプロパノールの使用、これはしばしば天然LDの破壊を引き起こし、細胞が固定されているにもかかわらず時折融合します39;(ii)ORO溶液は貯蔵寿命が限られているため、新鮮な粉末の溶解とろ過が必要なため、時間のかかる性質により、一貫性の低い結果に寄与します。(iii)そして、OROが単なる脂肪滴以上のものを染色し、しばしば肝脂肪症を過大評価するという事実38

その結果、Nile Redなどの細胞透過性親油性蛍光色素は、前述の制限のいくつかを克服するために、生サンプルまたは固定サンプルのいずれかで使用されてきました。しかし、細胞脂質オルガネラ標識の非特異的な性質は、LD評価を繰り返し狭めます40。さらに、ナイルレッドのスペクトル特性は環境の極性によって変化し、スペクトルシフト41につながることがよくあります。

親油性蛍光プローブである1,3,5,7,8-ペンタメチル-4-ボラ-3a,4ジアザ-s-インダセン(励起波長:480 nm; 発光極大:515 nm;BODIPY 493/503)は、細胞内LDによる迅速な取り込みを可能にする疎水性特性を示し、脂肪滴コアに蓄積し、続いて明るい緑色の蛍光を発する12。ナイルレッドとは異なり、BODIPY 493/503は環境の極性に敏感ではなく、LDイメージング用に高輝度を表示するため、より選択的であることが示されています。中性LDを染色するために、この色素は生細胞または固定細胞で使用でき、他の染色および/または標識法とうまく結合することができます42。色素の別の利点は、溶液に入れるのにほとんど労力を必要とせず、安定であり、したがって、各実験42のためにそれを新たに調製する必要性を排除することである。BODIPY 493/503プローブは、細胞培養におけるLDの局在と動態を可視化するために成功裏に使用されていますが、ヒト外側広筋43、ラットヒラメ筋42、マウス腸44などの組織におけるLDイメージングツールとしてのこの色素の信頼性の高い使用も実証されています。

ここでは、肝脂肪症の動物モデルからの肝臓検体のLD数、面積、および直径を評価するための代替分析アプローチとして、最適化されたBODIPY 493/503ベースのプロトコルを提案します。この手順では、肝臓サンプルの準備、組織切片作成、染色条件、画像取得、およびデータ分析について説明します。

Protocol

この研究で実施されたすべての動物の手順は、コインブラ臨床生物医学研究所(iCBR)の動物福祉団体(ORBEA、#9/2018)によって承認され、アニマルケア国内および欧州指令およびARRIVEガイドラインに準拠しています。 1. 実験計画 ペアハウス13週齢のオスのWistarラットを、温度(22°C±1°C)、湿度(50%-60%)、および明るい(12時間の明暗サイクル)の制御された環境条?…

Representative Results

この手法の実行に成功すると、LD形態(3D再構成に基づく形状と脂質コア密度)とその空間分布、総面積あたりの数、および平均サイズ(上記のパイプラインで評価、 図1)を同時に特性評価するための明確な脂肪滴染色が得られるはずです。 ?…

Discussion

この BODIPY 493/503 LD評価用蛍光ベースのプロトコルは、肝脂肪症の評価のための新しいイメージングアプローチを開発することを目的としていました。肥満と脂肪肝疾患との強い相関を考慮して、西洋式の高脂肪食を使用して肝脂肪症の動物モデルを確立しました26。肝TG含有量の力強い増加は、定量的トリグリセリド比色アッセイキットによって確認され、HFD給餌動物におけ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ポルトガル科学技術財団(FCT)、欧州地域開発基金(FEDER)、および競争要因プログラム(COMPETE):2020.09481.BD、UIDP/04539/2020(CIBB)、およびPOCI-01-0145-FEDER-007440 を介して 、国内および欧州基金から資金提供を受けました。著者らは、コインブラ大学医学部の施設であり、国家インフラPPBI-ポルトガルバイオイメージングプラットフォーム(POCI-01-0145-FEDER-022122)のメンバーであるiLAB顕微鏡およびバイオイメージングラボのサポート、およびFSE CENTRO-04-3559-FSE-000142のサポートに感謝します。

Materials

1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set Fisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503) Sigma-Aldrich, Lyon, France D3922
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR D1306
70% ethanol Honeywell 10191455
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Automatic analyzer Hitachi 717 Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany 8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen) Daido Sangyo Co., Ltd, Japon _
Blade Leica 221052145 Used in the cryostat
Cell Profiler version 4.2.5 https://cellprofiler.org/releases/ Used to analyse the acquired images
Coverslips Menzel-Glaser, Germany _
Cryomolds Tissue-Tek _
Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S Leica Biosystems _
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich, Lyon, France D-8418 Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic
and flammable. Vapors may cause
irritation. Manipulate in a fume
hood. Avoid direct contact with skin.
Wear rubber gloves, protective eye
goggles.
Dry ice container (styrofoam cooler) Novolab A26742
Dumont forceps Fine Science Tools, Germany 11295-10
Glass Petri dish (H 25 mm, ø
150 mm)
Thermo Scientific 150318 Used to weigh the liver after dissection
Glycergel DAKO Omnis S303023
GraphPad Prism software, version 9.3.1 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
High-fat diet Envigo, Barcelona, Spain MD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL) Dechra 791/01/14DFVPT Used at a final concentration of 75 mg/kg
Laser scanning confocal microscope  (QUASAR detection unit; ) Carl Zeiss, germany LSM 710 Axio Observer Z1 microscope
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Dechra 1838 ESP / 020/01/07RFVPT Used at a final concentration of 1 mg/kg
Needle BD microlance 300635
No 15 Sterile carbon steel scalpel
Blade
Swann-Morton 205
Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)  Carl Zeiss, Germany
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X  Used to handle cryosections
Peristaltic pump (Minipuls 3) Gilson 1004170
Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4) Sigma-Aldrich, Lyon, France P3813
Scalpel handle, 125 mm (5"), No. 3 Swann-Morton 0208
Slide staining system StainTray Simport Scientific M920
Standard diet  Mucedola 4RF21
Superfrost Plus microscope slides Menzel-Glaser, Germany J1800AMNZ
Tissue-Tek OCT mounting media VWR CHEMICALS 361603E
Triglycerides colorimetric assay kit Cayman Chemical 10010303
Ultrasonic bath Bandelin Sonorex  TK 52
Vannas spring scissors – 3 mm
cutting edge
Fine Science Tools, Germany 15000-00
ZEN Black software Zeiss

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Garcia, K., Alves, A., Ribeiro-Rodrigues, T. M., Reis, F., Viana, S. Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment. J. Vis. Exp. (196), e65206, doi:10.3791/65206 (2023).

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