Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado
Summary
Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.
Abstract
Certos estímulos, como microrganismos, fazem com que os neutrófilos liberem armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são basicamente estruturas semelhantes a teias compostas por DNA com proteínas de grânulos, como mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE), e proteínas citoplasmáticas e citoesqueléticas. Embora o interesse em NETs tenha aumentado recentemente, nenhum método de ensaio sensível e confiável está disponível para medir NETs em ambientes clínicos. Este artigo descreve um ensaio imunoenzimático modificado em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de NETs circulantes, complexos MPO-DNA e NE-DNA, que são componentes específicos de NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação de NETs. O ensaio utiliza anticorpos monoclonais específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção DNA-específico. MPO ou NE liga-se a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Este ensaio apresenta boa linearidade e alta precisão interensaio e intraensaio. Nós o usamos em 16 pacientes com COVID-19 com a síndrome do desconforto respiratório agudo associada e descobrimos que as concentrações plasmáticas de MPO-DNA e NE-DNA eram significativamente mais altas do que no plasma obtido de controles saudáveis. Este ensaio de detecção é um método confiável, altamente sensível e útil para investigar as características das NETs em sobrenadantes de plasma e cultura humanos.
Introduction
Este artigo descreve um método para quantificar a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NET) em fluidos biológicos usando ensaio imunoenzimático sanduíche (ELISA) para detectar complexos de mieloperoxidase (MPO) e elastase neutrofílica (NE) com DNA 1,2. As NETs são compostas por uma espinha dorsal de DNA decorada com proteases antimicrobianas originárias de grânulos de neutrófilos 3,4. Tanto o MPO-DNA quanto o NE-DNA complexos são componentes importantes e específicos das NETs e são liberados no espaço extracelular como produtos de degradação das NETs 3,4.
Além de seu importante papel fisiológico na defesa antimicrobiana3, os TNEs também apresentam vários efeitos patológicos4,5, incluindo a promoção da trombogênese6 e o agravamento da sepse7. Nesse sentido, as NETs vêm ganhando atenção recentemente. No entanto, a quantificação in vivo de NETs tem se mostrado desafiadora devido à falta de um método de ensaio quantitativo sensível e confiável.
Alguns métodos estão disponíveis, incluindo a medida direta de NETs por microscopia de fluorescência8,9 e citometria de fluxo10 e a medida indireta de DNA livre de células circulantes, nucleossomos e histona citrulinada H3, mas cada método tem suas próprias vantagens elimitações11. Embora o método microscópico de imunofluorescência seja específico para NETs e mostre claramente a localização e o grau de formação de NETs, as amostras são limitadas a tecido de biópsia e materiais secretados. Além disso, esse método precisa ser realizado por pesquisadores capacitados e requer muito tempo para que os resultados sejam obtidos. A medição dos níveis circulantes de componentes relacionados à NET por citometria de fluxo é fácil e fornece resultados rapidamente; no entanto, o método não é específico para NETs12.
Nós13 e outros1,2 desenvolvemos um ensaio altamente sensível e confiável para medir os componentes NET circulantes, DNA conjugado com MPO ou NE, em plasma humano com uma técnica de ELISA modificada que usa anticorpos específicos para MPO ou NE como anticorpos de captura e um anticorpo de detecção específico para DNA. Este ensaio também pode ser usado ex vivo para identificar componentes NET em sobrenadantes de cultura celular liberados por neutrófilos ativados em resposta à estimulação com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método de ELISA sanduíche no qual MPO ou NE se liga a um local do anticorpo de captura durante a incubação inicial de amostras contendo complexos MPO-DNA ou NE-DNA. Após a lavagem, o “sanduíche” é completado incubando as amostras com um anticorpo monoclonal anti-DNA associado à peroxidase. Após a remoção do anticorpo secundário não ligado, o conjugado peroxidase ligado é detectado pela adição de um substrato cromogênico ABTS peroxidase, que produz um produto final solúvel que pode ser lid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Huq Muhammad Aminul pela assistência na revisão do manuscrito.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
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