改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)
Summary
本稿では,活性化好中球由来の好中球細胞外トラップ残骸の2つの成分,ミエロペルオキシダーゼ抱合型DNAと好中球エラスターゼ抱合型DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ法のプロトコルについて紹介する。
Abstract
微生物などの特定の刺激により、好中球は好中球細胞外トラップ(NET)を放出しますが、これは基本的に、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)や好中球エラスターゼ(NE)などの顆粒タンパク質を含むDNAと細胞質および細胞骨格タンパク質で構成されるウェブ様構造です。近年NETへの関心が高まっていますが、臨床現場でNETを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイ法はありません。本稿では、NETの特定の成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出される循環NETの2つの成分であるMPO-DNAおよびNE-DNA複合体を定量的に測定するための改変サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイについて説明します。このアッセイでは、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的なモノクローナル抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用します。MPOまたはNEは、MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、捕捉抗体の1つの部位に結合します。このアッセイは、良好な直線性と高いアッセイ間およびアッセイ内精度を示します。急性呼吸窮迫症候群を伴うCOVID-19患者16例に使用したところ、MPO-DNAおよびNE-DNAの血漿中濃度が健常対照から得られた血漿中よりも有意に高いことがわかりました。この検出アッセイは、ヒト血漿および培養上清中のNETsの特性を調べるための信頼性が高く、高感度で有用な方法です。
Introduction
本稿では、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてミエロペルオキシダーゼ(MPO)と好中球エラスターゼ(NE)とDNA 1,2の複合体を検出することにより、体液中の好中球細胞外トラップ(NET)形成を定量する方法について概説します。NETは、好中球顆粒に由来する抗菌プロテアーゼで装飾されたDNA骨格で構成されています3,4。MPO-DNA複合体とNE-DNA複合体はどちらもNETの重要な特異的成分であり、NETの分解産物として細胞外空間に放出されます3,4。
NETは、抗菌防御における重要な生理学的役割3に加えて、血栓形成6の促進や敗血症7の悪化など、さまざまな病理学的効果4,5も持っています。そこで、最近はNETが注目されています。それにもかかわらず、NETのin vivo定量は、高感度で信頼性の高い定量アッセイ法がないため、困難であることが証明されています。
蛍光顕微鏡8,9およびフローサイトメトリー10によるNETの直接測定や、循環無細胞DNA、ヌクレオソーム、およびシトルリン化ヒストンH3の間接測定など、いくつかの方法が利用可能ですが、それぞれの方法には独自の利点と制限があります11。免疫蛍光顕微鏡法はNETに特異的であり、NET形成の局在と程度を明確に示していますが、サンプルは生検組織と分泌材料に限定されています。さらに、この方法は熟練した研究者が行う必要があり、結果が得られるまでに長い時間を必要とします。フローサイトメトリーによるNET関連成分の循環レベルの測定は簡単で、迅速に結果が得られます。ただし、このメソッドは NET12 に固有のものではありません。
We13およびその他1,2は、捕捉抗体としてMPOまたはNEに特異的な抗体を使用し、DNA特異的検出抗体を使用する修正ELISA技術を用いて、ヒト血漿中の循環NET成分であるMPO結合またはNE結合DNAを測定するための高感度で信頼性の高いアッセイを開発しました。このアッセイは、ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)刺激に応答して活性化好中球によって放出される細胞培養上清中のNET成分を同定するためにex vivoで使用することもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
MPO-DNAまたはNE-DNA複合体を含むサンプルの初期インキュベーション中に、MPOまたはNEがキャプチャ抗体の1つの部位に結合するサンドイッチELISA法について説明しました。洗浄後、サンプルをペルオキシダーゼ関連抗DNAモノクローナル抗体と共にインキュベートすることによって「サンドイッチ」が完成する。未結合の二次抗体を除去した後、発色性ABTSペルオキシダーゼ基質を添加することによ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、原稿のレビューを支援してくれたHuq Muhammad Aminul博士に感謝します。
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
