Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА
Summary
Представлен протокол модифицированного метода иммуноферментного анализа для количественного измерения двух компонентов остатков внеклеточной ловушки нейтрофилов: конъюгированной ДНК миелопероксидазы и конъюгированных ДНК нейтрофильной эластазы, полученных из активированных нейтрофилов.
Abstract
Некоторые раздражители, такие как микроорганизмы, заставляют нейтрофилы высвобождать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые в основном представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из ДНК с гранулярными белками, такими как миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза (НЭ), а также цитоплазматические и цитоскелетные белки. Несмотря на то, что интерес к НВЛ в последнее время возрос, не существует чувствительного и надежного метода анализа для измерения НВЛ в клинических условиях. В данной статье описан модифицированный сэндвич-фермент-связанный иммуносорбентный анализ для количественного измерения двух компонентов циркулирующих НВЛ, комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК, которые являются специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ. В анализе используются специфические моноклональные антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. МПО или НЭ связывается с одним участком захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. Этот анализ показывает хорошую линейность и высокую межпробирную и внутрипробную точность. Мы использовали его у 16 пациентов с COVID-19 с сопутствующим острым респираторным дистресс-синдромом и обнаружили, что плазменные концентрации МПО-ДНК и НЭ-ДНК были достоверно выше, чем в плазме, полученной от здоровых контрольных групп. Этот детектирующий анализ является надежным, высокочувствительным и полезным методом для исследования характеристик НВЛ в плазме крови и надосадочной жидкости культуры.
Introduction
В статье описан метод количественной оценки образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ) в биологических жидкостях с помощью сэндвич-ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА) для выявления комплексов миелопероксидазы (МПО) и нейтрофильной эластазы (НЭ) с ДНК 1,2. НВЛ состоят из ДНК-каркаса, украшенного антимикробными протеазами, происходящими из гранул нейтрофилов 3,4. Комплексы МПО-ДНК и НЭ-ДНК являются важными и специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ 3,4.
Помимо своей важной физиологической роли в противомикробной защите3, НВЛ также оказывают различные патологические эффекты4,5, включая стимулирование тромбогенеза6 и ухудшение сепсиса7. Соответственно, в последнее время НЭО привлекают к себе внимание. Тем не менее, количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей из-за отсутствия чувствительного и надежного метода количественного анализа.
Существует несколько методов, в том числе прямое измерение НВЛ с помощью флуоресцентной микроскопии8,9 и проточной цитометрии 10, а также косвенное измерение циркулирующей внеклеточной ДНК, нуклеосом и цитруллинированного гистонов H3, но каждый метод имеет свои преимущества и ограничения11. Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный микроскопический метод специфичен для НВЛ и четко показывает локализацию и степень образования НВЛ, образцы ограничиваются биопсийной тканью и секретируемыми материалами. Более того, этот метод должен выполняться квалифицированными исследователями и требует длительного времени для получения результатов. Измерение циркулирующих уровней компонентов, связанных с НВЛ, с помощью проточной цитометрии является простым и быстрым получением результатов; однако этот метод не является специфичным для NETs12.
Мы13 и другие1,2 разработали высокочувствительный и надежный анализ для измерения циркулирующих компонентов НВЛ, МПО-конъюгированной или NE-конъюгированной ДНК, в плазме крови человека с помощью модифицированной методики ИФА, которая использует специфические антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. Этот анализ также может быть использован ex vivo для идентификации компонентов НВЛ в супернатантах клеточных культур, высвобождаемых активированными нейтрофилами в ответ на стимуляцию форболом-12-миристат-13-ацетатом (ПМА).
Protocol
Representative Results
Discussion
Нами описан метод сэндвич-ИФА, при котором МПО или НЭ связываются с одним сайтом захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. После промывки «бутерброд» завершается инкубацией образцов с пероксидаза-ассоциированным анти-ДНК моноклона?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Хука Мухаммада Аминула за помощь в рецензировании рукописи.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
