Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi
Summary
Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Mikroorganizmalar gibi bazı uyaranlar, nötrofillerin, temel olarak miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) gibi granül proteinli DNA’dan ve sitoplazmik ve hücre iskeleti proteinlerinden oluşan ağ benzeri yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakları (NET’ler) serbest bırakmasına neden olur. Son zamanlarda NET’lere olan ilgi artmış olsa da, klinik ortamlarda NET’leri ölçmek için hassas, güvenilir bir test yöntemi mevcut değildir. Bu makalede, NET’lerin spesifik bileşenleri olan ve NET’lerin parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınan dolaşımdaki NET’lerin iki bileşenini, MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi açıklanmaktadır. Test, yakalama antikorları ve DNA’ya özgü bir tespit antikoru olarak MPO veya NE için spesifik monoklonal antikorlar kullanır. MPO veya NE, MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında yakalama antikorunun bir bölgesine bağlanır. Bu tahlil, iyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet gösterir. Eşlik eden akut solunum sıkıntısı sendromu olan COVID-19’lu 16 hastada kullandık ve MPO-DNA ve NE-DNA’nın plazma konsantrasyonlarının sağlıklı kontrollerden elde edilen plazmadan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. Bu tespit testi, insan plazması ve kültür süpernatantlarındaki NET’lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.
Introduction
Bu makale, DNA 1,2 ile miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) komplekslerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak biyolojik sıvılarda nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu ölçmek için bir yöntemi özetlemektedir. NET’ler, nötrofil granüllerinden kaynaklanan antimikrobiyal proteazlarla süslenmiş bir DNA omurgasından oluşur 3,4. Hem MPO-DNA hem de NE-DNA kompleksleri, NET’lerin önemli ve spesifik bileşenleridir ve NET’lerinparçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınır 3,4.
Antimikrobiyal savunmadaki önemli fizyolojik rollerinin3 yanı sıra, NET’lerin trombogenezin6 teşviki ve sepsisinkötüleşmesi 7 dahil olmak üzere çeşitli patolojik etkileri de vardır 4,5. Bu doğrultuda, NET’ler son zamanlarda dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, NET’lerin in vivo kantitifikasyonu, hassas, güvenilir bir kantitatif test yönteminin olmaması nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır.
NET’lerin floresan mikroskobu8,9 ve akış sitometrisi 10 ile doğrudan ölçümü ve dolaşımdaki hücresiz DNA, nükleozomlar ve sitrüline histon H3’ün dolaylı ölçümü dahil olmak üzere birkaç yöntem mevcuttur, ancak her yöntemin kendi avantajları ve sınırlamalarıvardır 11. İmmünofloresan mikroskobik yöntem NET’lere özgü olmasına ve NET oluşumunun lokalizasyonunu ve derecesini net olarak göstermesine rağmen, örnekler biyopsi dokusu ve salgılanan materyallerle sınırlıdır. Üstelik bu yöntemin yetenekli araştırmacılar tarafından yapılması gerekiyor ve sonuçların elde edilmesi uzun zaman alıyor. NET ile ilgili bileşenlerin dolaşımdaki seviyelerinin akış sitometrisi ile ölçülmesi kolaydır ve hızlı bir şekilde sonuç verir; ancak, yöntem NET12’ye özgü değildir.
Biz13 ve diğerleri1,2, yakalama antikorları olarak MPO veya NE için spesifik antikorlar ve DNA’ya özgü bir tespit antikoru kullanan modifiye edilmiş bir ELISA tekniği ile insan plazmasında dolaşımdaki NET bileşenlerini, MPO-konjuge veya NE-konjuge DNA’yı ölçmek için oldukça hassas ve güvenilir bir test geliştirdik. Bu test, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stimülasyonuna yanıt olarak aktive edilmiş nötrofiller tarafından salınan hücre kültürü süpernatantlarındaki NET bileşenlerini tanımlamak için ex vivo olarak da kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında MPO veya NE’nin yakalama antikorunun bir bölgesine bağlandığı bir sandviç ELISA yöntemini tanımladık. Yıkandıktan sonra, numunelerin peroksidaz ile ilişkili bir anti-DNA monoklonal antikoru ile inkübe edilmesiyle “sandviç” tamamlanır. Bağlanmamış sekonder antikorun çıkarılmasından sonra, bağlı peroksidaz konjugatı, 405 nm’de spektrofotometrik olarak okunabilen çözünür bir son ürün veren bir kromojenik ABTS per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, makalenin gözden geçirilmesinde yardımcı olduğu için Dr. Huq Muhammad Aminul’a teşekkür eder.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
