כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ’ שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ”א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.
Abstract
גירויים מסוימים, כגון מיקרואורגניזמים, גורמים לנויטרופילים לשחרר מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs), שהם בעצם מבנים דמויי רשת המורכבים מדנ”א עם חלבוני גרגירים, כגון myeloperoxidase (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE), וחלבונים ציטופלזמיים וציטו-שלד. למרות שהעניין ב- NETs גדל לאחרונה, אין שיטת בדיקה רגישה ואמינה זמינה למדידת NETs במסגרות קליניות. מאמר זה מתאר בדיקה אימונוסורבנטית המקושרת לאנזים סנדוויץ’ שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של NETs במחזור, MPO-DNA וקומפלקסים NE-DNA, שהם רכיבים ספציפיים של NETs ומשוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs. הבדיקה משתמשת בנוגדנים חד-שבטיים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. MPO או NE נקשר לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. בדיקה זו מראה ליניאריות טובה ודיוק גבוה בין בדיקות ותוך מבחנים. השתמשנו בו ב-16 חולי COVID-19 עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה נלווית ומצאנו כי ריכוזי ה-MPO-DNA וה-NE-DNA בפלזמה היו גבוהים משמעותית מאשר בפלזמה שהתקבלה מקבוצת ביקורת בריאה. בדיקת זיהוי זו היא שיטה אמינה, רגישה ביותר ושימושית לחקירת המאפיינים של NETs בפלזמה אנושית ובתרבית-על.
Introduction
מאמר זה מתאר שיטה לכימות היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ-תאיים (NET) בנוזלים ביולוגיים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים סנדוויץ’ (ELISA) כדי לזהות קומפלקסים של מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים (NE) עם DNA 1,2. NETs מורכבים מעמוד שדרה של DNA המעוטר בפרוטאזות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בגרגרי נויטרופילים 3,4. הן קומפלקסים MPO-DNA והן NE-DNA הם מרכיבים חשובים וספציפיים של NETs והם משוחררים לחלל החוץ תאי כתוצרי פירוק של NETs 3,4.
מלבד תפקידם הפיזיולוגי החשוב בהגנה אנטי-מיקרוביאלית3, ל-NETs יש גם השפעות פתולוגיות שונות4,5, כולל קידום טרומבוגנזה6 והחמרה באלח דם7. בהתאם לכך, רשתות צוברים תשומת לב לאחרונה. עם זאת, כימות in vivo של NETs הוכח כמאתגר בשל היעדר שיטת בדיקה כמותית רגישה ואמינה.
קיימות מספר שיטות, כולל מדידה ישירה של NETs במיקרוסקופ פלואורסצנטי8,9 וציטומטריית זרימה 10 ומדידה עקיפה של דנ”א נטול תאים במחזור, נוקלאוזומים והיסטון H3 ציטרולינציה, אך לכל שיטה יתרונות ומגבלות משלה11. למרות שהשיטה המיקרוסקופית האימונופלואורסצנטית היא ספציפית ל- NETs ומראה בבירור את הלוקליזציה ואת מידת היווצרות ה- NET, הדגימות מוגבלות לרקמת ביופסיה וחומרים מופרשים. יתר על כן, שיטה זו צריכה להתבצע על ידי חוקרים מיומנים ודורשת זמן רב לקבלת תוצאות. מדידת רמות במחזור של רכיבים הקשורים ל- NET באמצעות ציטומטריית זרימה היא קלה ומספקת תוצאות במהירות; עם זאת, השיטה אינה ספציפית ל- NETs12.
אנו13 ואחרים1,2 פיתחנו בדיקה רגישה ואמינה ביותר למדידת רכיבי NET במחזור, MPO-conjugated או NE-conjugated DNA, בפלזמה אנושית עם טכניקת ELISA שונה המשתמשת בנוגדנים ספציפיים עבור MPO או NE כנוגדנים ללכידה ונוגדן זיהוי ספציפי ל- DNA. בדיקה זו יכולה לשמש גם ex vivo כדי לזהות רכיבי NET בסופרנאטנטים של תרביות תאים המשתחררים על ידי נויטרופילים פעילים בתגובה לגירוי phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).
Protocol
Representative Results
Discussion
תיארנו שיטת סנדוויץ’ ELISA שבה MPO או NE נקשרים לאתר אחד של נוגדן הלכידה במהלך הדגירה הראשונית של דגימות המכילות מתחמי MPO-DNA או NE-DNA. לאחר השטיפה, “הכריך” הושלם על ידי דגירה של הדגימות עם נוגדן חד שבטי הקשור לפרוקסידז נגד DNA. לאחר הסרת נוגדן משני לא קשור, מצומד הפרוקסידז הכבול מזוהה על ידי תוספת של מצ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר הוק מוחמד אמינול על סיועו בעיון בכתב היד.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
