Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA
Summary
We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.
Abstract
Bepaalde stimuli, zoals micro-organismen, zorgen ervoor dat neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) vrijgeven, die in feite webachtige structuren zijn die zijn samengesteld uit DNA met korreleiwitten, zoals myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE), en cytoplasmatische en cytoskeletale eiwitten. Hoewel de belangstelling voor NET’s de laatste tijd is toegenomen, is er geen gevoelige, betrouwbare testmethode beschikbaar voor het meten van NET’s in klinische omgevingen. Dit artikel beschrijft een gemodificeerde sandwichenzym-gebonden immunosorbenttest om twee componenten van circulerende NET’s, MPO-DNA en NE-DNA-complexen, kwantitatief te meten, die specifieke componenten van NET’s zijn en in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven als afbraakproducten van NET’s. De test gebruikt specifieke monoklonale antilichamen voor MPO of NE als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA of NE-DNA-complexen bevatten. Deze assay toont een goede lineariteit en een hoge inter-assay en intra-assay precisie. We gebruikten het bij 16 patiënten met COVID-19 met bijbehorend acuut respiratoir distress-syndroom en vonden dat de plasmaconcentraties van MPO-DNA en NE-DNA significant hoger waren dan in het plasma verkregen uit gezonde controles. Deze detectietest is een betrouwbare, zeer gevoelige en nuttige methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET’s in menselijk plasma en kweeksupernatanten.
Introduction
Dit artikel schetst een methode om de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET) in biologische vloeistoffen te kwantificeren met behulp van sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) om complexen van myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE) te detecteren met DNA 1,2. NET’s bestaan uit een DNA-ruggengraat versierd met antimicrobiële proteasen afkomstig van neutrofiele korrels 3,4. Zowel MPO-DNA- als NE-DNA-complexen zijn belangrijke en specifieke componenten van NET’s en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte als afbraakproducten van NETs 3,4.
Naast hun belangrijke fysiologische rol in antimicrobiële afweer3, hebben NET’s ook verschillende pathologische effecten4,5, waaronder de bevordering van trombogenese6 en de verergering van sepsis7. Dienovereenkomstig hebben NET’s de laatste tijd aandacht gekregen. Niettemin is de in vivo kwantificering van NET’s een uitdaging gebleken vanwege het ontbreken van een gevoelige, betrouwbare kwantitatieve testmethode.
Er zijn enkele methoden beschikbaar, waaronder de directe meting van NET’s door fluorescentiemicroscopie8,9 en flowcytometrie 10 en de indirecte meting van circulerend celvrij DNA, nucleosomen en citrullinated histon H3, maar elke methode heeft zijn eigen voordelen en beperkingen11. Hoewel de immunofluorescentiemicroscopische methode specifiek is voor NET’s en duidelijk de lokalisatie en mate van NET-vorming laat zien, zijn monsters beperkt tot biopsieweefsel en uitgescheiden materialen. Bovendien moet deze methode worden uitgevoerd door bekwame onderzoekers en duurt het lang voordat resultaten worden verkregen. Het meten van circulerende niveaus van NET-gerelateerde componenten door middel van flowcytometrie is eenvoudig en levert snel resultaten op; De methode is echter niet specifiek voor NET’s12.
Wij13 en anderen1,2 hebben een zeer gevoelige en betrouwbare test ontwikkeld om de circulerende NET-componenten, MPO-geconjugeerd of NE-geconjugeerd DNA, in menselijk plasma te meten met een gemodificeerde ELISA-techniek die specifieke antilichamen voor MPO of NE gebruikt als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. Deze test kan ook ex vivo worden gebruikt om NET-componenten te identificeren in celkweeksupernatanten die vrijkomen door geactiveerde neutrofielen als reactie op phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) stimulatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een sandwich ELISA-methode beschreven waarbij MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA- of NE-DNA-complexen bevatten. Na het wassen wordt de “sandwich” voltooid door de monsters te incuberen met een peroxidase-geassocieerd anti-DNA monoklonaal antilichaam. Na de verwijdering van ongebonden secundair antilichaam wordt het gebonden peroxidaseconjugaat gedetecteerd door de toevoeging van een chromogeen ABTS-peroxidasesubstraat, dat een oplosbaar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Huq Muhammad Aminul voor het verlenen van hulp bij het beoordelen van het manuscript.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
