Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato
Summary
Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.
Abstract
Alcuni stimoli, come i microrganismi, inducono i neutrofili a rilasciare trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono fondamentalmente strutture simili a ragnatele composte da DNA con proteine granulari, come la mieloperossidasi (MPO) e l’elastasi neutrofila (NE), e proteine citoplasmatiche e citoscheletriche. Sebbene l’interesse per i NET sia aumentato di recente, non è disponibile alcun metodo di analisi sensibile e affidabile per la misurazione dei NET in ambito clinico. Questo articolo descrive un saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificato per misurare quantitativamente due componenti dei NET circolanti, i complessi MPO-DNA e NE-DNA, che sono componenti specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET. Il test utilizza anticorpi monoclonali specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. MPO o NE si lega a un sito dell’anticorpo di cattura durante l’incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Questo test mostra una buona linearità e un’elevata precisione tra saggi e intrados. Lo abbiamo usato in 16 pazienti con COVID-19 con sindrome da distress respiratorio acuto e abbiamo scoperto che le concentrazioni plasmatiche di MPO-DNA e NE-DNA erano significativamente più alte rispetto al plasma ottenuto da controlli sani. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET nel plasma umano e nei surnatanti di coltura.
Introduction
Questo articolo delinea un metodo per quantificare la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET) nei fluidi biologici utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per rilevare complessi di mieloperossidasi (MPO) ed elastasi neutrofila (NE) con DNA 1,2. I NET sono composti da una spina dorsale di DNA decorata con proteasi antimicrobiche originate da granuli di neutrofili 3,4. Sia i complessi MPO-DNA che NE-DNA sono componenti importanti e specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET 3,4.
Oltre al loro importante ruolo fisiologico nella difesa antimicrobica3, i NET hanno anche vari effetti patologici4,5, tra cui la promozione della trombogenesi6 e il peggioramento della sepsi7. Di conseguenza, le NET hanno recentemente attirato l’attenzione. Ciononostante, la quantificazione in vivo dei NET si è dimostrata impegnativa a causa della mancanza di un metodo di analisi quantitativa sensibile e affidabile.
Sono disponibili alcuni metodi, tra cui la misurazione diretta dei NET mediante microscopia a fluorescenza8,9 e citometria a flusso 10 e la misurazione indiretta del DNA libero circolante, dei nucleosomi e dell’istone citrullinato H3, ma ogni metodo presenta i propri vantaggi e limiti11. Sebbene il metodo microscopico a immunofluorescenza sia specifico per i NET e mostri chiaramente la localizzazione e il grado di formazione dei NET, i campioni sono limitati al tessuto bioptico e ai materiali secreti. Inoltre, questo metodo deve essere eseguito da ricercatori qualificati e richiede molto tempo per ottenere risultati. Misurare i livelli circolanti di componenti correlati al NET mediante citometria a flusso è facile e fornisce risultati rapidi; tuttavia, il metodo non è specifico per NET12.
Noi13 e altri1,2 abbiamo sviluppato un test altamente sensibile e affidabile per misurare i componenti circolanti del NET, DNA coniugato con MPO o coniugato con NE, nel plasma umano con una tecnica ELISA modificata che utilizza anticorpi specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. Questo saggio può anche essere utilizzato ex vivo per identificare i componenti NET nei surnatanti delle colture cellulari rilasciati dai neutrofili attivati in risposta alla stimolazione del forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto un metodo ELISA a sandwich in cui MPO o NE si legano a un sito dell’anticorpo di cattura durante l’incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Dopo il lavaggio, il “sandwich” viene completato incubando i campioni con un anticorpo monoclonale anti-DNA associato alla perossidasi. Dopo la rimozione dell’anticorpo secondario non legato, il coniugato della perossidasi legata viene rilevato mediante l’aggiunta di un substrato cromogenico di perossidasi ABTS, che produce un prodotto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Huq Muhammad Aminul per l’assistenza fornita nella revisione del manoscritto.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
