Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.
Abstract
Bestimmte Stimuli, wie z. B. Mikroorganismen, veranlassen Neutrophile, neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freizusetzen, bei denen es sich im Wesentlichen um netzartige Strukturen handelt, die aus DNA mit Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) sowie zytoplasmatischen und zytoskelettalen Proteinen bestehen. Obwohl das Interesse an NETs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es keine empfindliche, zuverlässige Testmethode für die Messung von NETs im klinischen Umfeld. Dieser Artikel beschreibt einen modifizierten Sandwich-Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assay zur quantitativen Messung von zwei Komponenten zirkulierender NETs, MPO-DNA und NE-DNA-Komplexe, die spezifische Bestandteile von NETs sind und als Abbauprodukte von NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Der Assay verwendet spezifische monoklonale Antikörper gegen MPO oder NE als Fängerantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper. MPO oder NE bindet während der ersten Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers. Dieser Assay weist eine gute Linearität und eine hohe Präzision zwischen und innerhalb des Assays auf. Wir setzten es bei 16 Patienten mit COVID-19 und damit einhergehendem akutem Atemnotsyndrom ein und stellten fest, dass die Plasmakonzentrationen von MPO-DNA und NE-DNA signifikant höher waren als im Plasma gesunder Kontrollen. Dieser Detektionsassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in humanen Plasma- und Kulturüberständen.
Introduction
In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der Bildung von extrazellulären Fallen (NET) in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, indem der Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet wird, um Komplexe von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) mit DNA 1,2 nachzuweisen. NETs bestehen aus einem DNA-Rückgrat, das mit antimikrobiellen Proteasen aus neutrophilen Granula dekoriert ist 3,4. Sowohl MPO-DNA- als auch NE-DNA-Komplexe sind wichtige und spezifische Bestandteile von NETs und werden als Abbauprodukte von NETsin den extrazellulären Raum freigesetzt 3,4.
Neben ihrer wichtigen physiologischen Rolle bei der antimikrobiellen Abwehr3 haben NETs auch verschiedene pathologische Wirkungen4,5, einschließlich der Förderung der Thrombogenese6 und der Verschlechterung der Sepsis7. Dementsprechend haben NETs in letzter Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Nichtsdestotrotz hat sich die In-vivo-Quantifizierung von NETs als schwierig erwiesen, da es keine empfindliche, zuverlässige quantitative Assay-Methode gibt.
Es stehen einige Methoden zur Verfügung, darunter die direkte Messung von NETs mittels Fluoreszenzmikroskopie8,9 und Durchflusszytometrie 10 sowie die indirekte Messung von zirkulierender zellfreier DNA, Nukleosomen und citrulliniertem Histon H3, aber jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen11. Obwohl die immunfluoreszenzmikroskopische Methode spezifisch für NETs ist und die Lokalisation und den Grad der NET-Bildung deutlich zeigt, sind die Proben auf Biopsiegewebe und sezernierte Materialien beschränkt. Darüber hinaus muss diese Methode von erfahrenen Forschern durchgeführt werden und erfordert eine lange Zeit, bis Ergebnisse vorliegen. Die Messung der zirkulierenden Konzentrationen von NET-bezogenen Komponenten mittels Durchflusszytometrie ist einfach und liefert schnell Ergebnisse. Die Methode ist jedoch nicht spezifisch für NETs12.
Wir13 und andere 1,2 haben einen hochempfindlichen und zuverlässigen Assay entwickelt, um die zirkulierenden NET-Komponenten, MPO-konjugierte oder NE-konjugierte DNA, in menschlichem Plasma mit einer modifizierten ELISA-Technik zu messen, die spezifische Antikörper für MPO oder NE als Fangantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper verwendet. Dieser Assay kann auch ex vivo verwendet werden, um NET-Komponenten in Zellkulturüberständen zu identifizieren, die von aktivierten Neutrophilen als Reaktion auf die Stimulation von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) freigesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben eine Sandwich-ELISA-Methode beschrieben, bei der MPO oder NE während der anfänglichen Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers bindet. Nach dem Waschen wird das “Sandwich” vervollständigt, indem die Proben mit einem Peroxidase-assoziierten monoklonalen Anti-DNA-Antikörper inkubiert werden. Nach der Entfernung des ungebundenen Sekundärantikörpers wird das gebundene Peroxidase-Konjugat durch Zugabe eines chromogenen ABTS-Peroxidase-Substrats …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Huq Muhammad Aminul für die Unterstützung bei der Begutachtung des Manuskripts.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
