Summary

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Abstract

Ciertos estímulos, como los microorganismos, hacen que los neutrófilos liberen trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son básicamente estructuras en forma de red compuestas de ADN con proteínas granulosas, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE), y proteínas citoplasmáticas y citoesqueléticas. Aunque el interés en los TNE ha aumentado recientemente, no se dispone de un método de ensayo sensible y fiable para medir los TNE en entornos clínicos. En este artículo se describe un ensayo de inmunoabsorción enzimática en sándwich modificado para medir cuantitativamente dos componentes de los TNE circulantes, los complejos MPO-ADN y NE-ADN, que son componentes específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE. El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-DNA o NE-ADN. Este ensayo muestra una buena linealidad y una alta precisión entre ensayos e intraensayos. Lo utilizamos en 16 pacientes con COVID-19 con síndrome de dificultad respiratoria aguda acompañante y encontramos que las concentraciones plasmáticas de MPO-DNA y NE-DNA eran significativamente más altas que en el plasma obtenido de controles sanos. Este ensayo de detección es un método fiable, altamente sensible y útil para investigar las características de los NET en plasma humano y sobrenadantes de cultivo.

Introduction

Este artículo describe un método para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en fluidos biológicos mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich (ELISA) para detectar complejos de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) con ADN 1,2. Los TNE están compuestos por una columna vertebral de ADN decorada con proteasas antimicrobianas que se originan a partir de gránulos de neutrófilos 3,4. Tanto los complejos MPO-ADN como NE-ADN son componentes importantes y específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE 3,4.

Además de su importante papel fisiológico en la defensa antimicrobiana3, los TNE también tienen varios efectos patológicos4,5, incluyendo la promoción de la trombogénesis6 y el empeoramiento de la sepsis7. En consecuencia, las NET han ido ganando atención recientemente. Sin embargo, la cuantificación in vivo de los NET ha demostrado ser un reto debido a la falta de un método de ensayo cuantitativo sensible y fiable.

Existen algunos métodos, incluida la medición directa de los NET mediante microscopía de fluorescencia8,9 y citometría de flujo 10 y la medición indirecta del ADN libre de células circulantes, los nucleosomas y la histona C3 citrulinada, pero cada método tiene sus propias ventajas y limitaciones11. Aunque el método microscópico de inmunofluorescencia es específico de los tumores neuroendocrinos y muestra claramente la localización y el grado de formación de los tumores neuroendocrinos, las muestras se limitan al tejido de la biopsia y a los materiales secretados. Además, este método debe ser realizado por investigadores calificados y requiere mucho tiempo para obtener resultados. La medición de los niveles circulantes de componentes relacionados con NET mediante citometría de flujo es fácil y proporciona resultados rápidamente; sin embargo, el método no es específico de las NET12.

Nosotros13 y otros1,2 hemos desarrollado un ensayo altamente sensible y confiable para medir los componentes circulantes de NET, ADN conjugado con MPO o conjugado con NE, en plasma humano con una técnica ELISA modificada que utiliza anticuerpos específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. Este ensayo también se puede utilizar ex vivo para identificar los componentes de NET en los sobrenadantes de cultivo celular liberados por los neutrófilos activados en respuesta a la estimulación del forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

Protocol

Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Médica de Aichi (2017-H341, 2019-H137). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante. 1. Preparación de reactivos NOTA: Para realizar el ensayo ELISA sándwich, los reactivos se preparan como se describe a continuación. Tampón de recubrimiento:Para hace…

Representative Results

Este método utilizó un ELISA sándwich con anticuerpos monoclonales anti-MPO, anti-NE y anti-ADN para medir el ADN asociado a MPO y al NE (Figura 1). En este método, los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con un anticuerpo monoclonal específico de MPO o NE específico para capturar MPO asociada al ADN y NE asociada al ADN, así como MPO y NE no asociadas al ADN. Para calcular el coeficiente de variabilidad (CV) intraensayo, se realizaron mediciones duplicadas dentro…

Discussion

Hemos descrito un método ELISA sándwich en el que MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-ADN o NE-ADN. Después del lavado, el “sándwich” se completa incubando las muestras con un anticuerpo monoclonal anti-ADN asociado a la peroxidasa. Después de la eliminación del anticuerpo secundario no unido, el conjugado de peroxidasa unido se detecta mediante la adición de un sustrato cromogénico de peroxidasa ABTS, que produce un producto …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen al Dr. Huq Muhammad Aminul por su ayuda en la revisión del manuscrito.

Materials

1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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