Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié
Summary
Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.
Abstract
Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.
Introduction
Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN 1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles 3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE 3,4.
Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne3, les TNE ont également divers effets pathologiques4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse6 et l’aggravation de la septicémie7. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.
Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites11. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE12.
Nous13 et al. 1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Dr Huq Muhammad Aminul pour leur aide dans la révision du manuscrit.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
