القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة
Summary
نقدم بروتوكولا لتقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم شطيرة معدلة لقياس مكونين من بقايا فخ العدلات خارج الخلية كميا ، وهما الحمض النووي المترافق للميلوبيروكسيديز ومجمعات الحمض النووي المترافق لإيلاستاز العدلات ، المشتقة من العدلات المنشطة.
Abstract
تتسبب بعض المحفزات ، مثل الكائنات الحية الدقيقة ، في إطلاق العدلات لمصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي في الأساس هياكل تشبه الويب تتكون من الحمض النووي مع البروتينات الحبيبية ، مثل الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) ، والبروتينات السيتوبلازمية والهيكلية الخلوية. على الرغم من أن الاهتمام بالشبكات قد زاد مؤخرا ، إلا أنه لا توجد طريقة فحص حساسة وموثوقة متاحة لقياس الشبكات في البيئات السريرية. تصف هذه المقالة مقايسة ممتز مناعي معدل مرتبط بالإنزيم لقياس مكونين من مكونات الشبكات المنتشرة كميا ، مجمعات MPO-DNA و NE-DNA ، وهي مكونات محددة من NETs ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار NETs. يستخدم الفحص أجساما مضادة وحيدة النسيلة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يرتبط MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي يتم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. يظهر هذا الفحص خطيا جيدا ودقة عالية بين المقايسة وداخل المقايسة. استخدمناه في 16 مريضا مصابا ب COVID-19 يعانون من متلازمة الضائقة التنفسية الحادة المصاحبة ووجدنا أن تركيزات البلازما من MPO-DNA و NE-DNA كانت أعلى بكثير من البلازما التي تم الحصول عليها من الضوابط الصحية. يعد اختبار الكشف هذا طريقة موثوقة وحساسة للغاية ومفيدة للتحقيق في خصائص الشبكات في البلازما البشرية وطافات الثقافة.
Introduction
توضح هذه المقالة طريقة لتحديد تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية (NET) في السوائل البيولوجية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم الساندويتش (ELISA) للكشف عن معقدات الميلوبيروكسيديز (MPO) وإيلاستاز العدلات (NE) مع الحمض النووي1،2. تتكون الشبكات من العمود الفقري للحمض النووي المزين بالبروتياز المضاد للميكروبات الناشئة من حبيبات العدلات 3,4. تعد كل من معقدات MPO-DNA و NE-DNA مكونات مهمة ومحددة للشبكات ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية كمنتجات انهيار ل NETs 3,4.
إلى جانب دورها الفسيولوجي الهام في الدفاع المضاد للميكروبات3 ، فإن الشبكات لها أيضا تأثيرات مرضية مختلفة 4,5 ، بما في ذلك تعزيز تكوين الخثار6 وتفاقم الإنتان7. وبناء على ذلك، حظيت الشبكات بالاهتمام في الآونة الأخيرة. ومع ذلك، فقد ثبت أن القياس الكمي للشبكات في الجسم الحي يمثل تحديا بسبب عدم وجود طريقة اختبار كمية حساسة وموثوقة.
تتوفر بعض الطرق ، بما في ذلك القياس المباشر للشبكات بواسطة المجهر الفلوري 8,9 وقياس التدفق الخلوي 10 والقياس غير المباشر للحمض النووي الخالي من الخلايا ، والنيوكليوسومات ، وهيستون سيترولين H3 ، ولكن كل طريقة لها مزاياها وقيودهاالخاصة 11. على الرغم من أن الطريقة المجهرية المناعية خاصة بالشبكات وتظهر بوضوح توطين ودرجة تكوين NET ، إلا أن العينات تقتصر على أنسجة الخزعة والمواد المفرزة. علاوة على ذلك ، يجب أن يتم تنفيذ هذه الطريقة من قبل باحثين مهرة وتتطلب وقتا طويلا للحصول على النتائج. يعد قياس المستويات المتداولة للمكونات المرتبطة بالشبكة عن طريق قياس التدفق الخلوي أمرا سهلا ويوفر نتائج سريعة ؛ ومع ذلك ، فإن الطريقة ليست خاصة بالشبكات12.
لقد طورنانحن 13 وآخرون 1,2 مقايسة حساسة للغاية وموثوقة لقياس مكونات NET المتداولة ، الحمض النووي المترافق MPO أو NE المترافق ، في البلازما البشرية باستخدام تقنية ELISA المعدلة التي تستخدم أجساما مضادة محددة ل MPO أو NE كأجسام مضادة للالتقاط وجسم مضاد للكشف عن الحمض النووي. يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار خارج الجسم الحي لتحديد مكونات NET في طافات زراعة الخلايا التي تطلقها العدلات المنشطة استجابة لتحفيز phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA).
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وصفنا طريقة شطيرة ELISA التي يرتبط فيها MPO أو NE بموقع واحد من الجسم المضاد الذي تم التقاطه أثناء الحضانة الأولية للعينات التي تحتوي على مجمعات MPO-DNA أو NE-DNA. بعد الغسيل ، يتم الانتهاء من “الساندويتش” عن طريق احتضان العينات بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للحمض النووي مرتبط بالبيروكسيداز. بعد إز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور حق محمد أمينول على مساعدته في مراجعة المخطوطة.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
