Markierungsfreie nichtlineare Optik zur Untersuchung von Tubulin-abhängigen Defekten im zentralen Myelin

Die optische Bildgebung von Zytoskelettstrukturen in Geweben und Organpräparaten ist keine leichte Aufgabe. Zytoskelettfilamente sind allgegenwärtig, so dass, wenn eine generische Färbung durchgeführt wird, zum Beispiel gegen Alpha-Tubulin oder Beta-Aktin oder möglicherweise Keratin in einer Epithelprobe, das Signal wahrscheinlich ziemlich homogen über die gesamte Probe verteilt wird. Um die Färbung auf eine aussagekräftigere Teilmenge zellulärer Komponenten zu beschränken, kann man entweder transgene Mäuse mit gezielter Expression¹ verwenden oder isoformspezifische Antikörper verwenden. Während nur sehr wenige der letzteren auf dem Markt sind (und nur sehr wenige existieren ^2,3,4), könnte ein transgenes Tiermodell verfügbar sein. Es muss jedoch vom Labor erworben und ordnungsgemäß untergebracht werden, mit allen Kosten, die mit dem Prozess verbunden sind. Bestimmte Antikörper oder Chemikalien, z. B. Fluorophor-konjugierte Arzneimittel wie Phalloidin oder Paclitaxel, können teilweise oder vollständig mit der Anwendung in lebenden Zellen oder Geweben unvereinbar sein, so dass ihre Anwendbarkeit auf Studien an festen Proben beschränkt ist.

Im Falle von Tubulin muss ein weiterer Aspekt berücksichtigt werden, nämlich die Empfindlichkeit des Polymers gegenüber der Fixierung. Die konventionelle chemische Fixierung mit Formaldehyd ist dafür bekannt, dass sie nicht ausreicht, um die Integrität von Mikrotubuli optimal zu erhalten⁵. Darüber hinaus bestätigt ein kürzlich veröffentlichter Bericht, dass die Formaldehydvernetzung subtile Veränderungen in der Ultrastruktur des Mikrotubuli induziert, ähnlich wie bei der Bindung einiger Medikamente oder physiologischer Moleküle wie GTP⁶.

Die direkte Visualisierung von Mikrotubuli in ungefärbten, nicht fixierten Proben ist daher oft wünschenswert. Um dies zu erreichen, ist die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)⁷, die auf der Fähigkeit von Bündeln paralleler Mikrotubuli basiert, als Harmonophore zu fungieren und frequenzverdoppeltes Licht zu emittieren, wenn sie mit einem intensiven, gepulsten Infrarotlaser richtig beleuchtet werden. Obwohl ein stärkeres und stabileres Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen und Myosin erzeugt werden kann, die die einzigen beiden anderen biologischen Materialien sind, von denen bekannt ist, dass sie zur Frequenzverdopplung fähig sind, wurde das Signal von Tubulin bisher hauptsächlich verwendet, um mitotische Spindelumlagerungen ^8,9,10 und axonale Mikrotubuli^{Morphologie 11,12,13} zu untersuchen.

In dieser Arbeit stellen wir eine neuartige Anwendung der SHG-Mikroskopie als diagnostisches Werkzeug vor, um Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), die von Tubulin-beta-4-A (TUBB4A)-Tubulinopathie betroffen sind, von ihren gesunden Gegenstücken^{zu unterscheiden 14}. Einige der Mutationen, die in dieser überwiegend neuralen Isoform von Tubulin auftreten, wie diejenigen, die Hypomyelinisierung und Atrophie der Basalganglien und des Kleinhirns (H-ABC) verursachen, induzieren eine Überfüllung der Mikrotubuli in den Oligodendrozyten^15,16; Die Veränderungen des Zytoskeletts sind wiederum mit nachgeschalteten Effekten wie Dysmyelinisierung verbunden, mit einer tiefgreifenden Beeinträchtigung der motorischen und sensorischen Bahnen^16,17,18,19. Das in dieser Arbeit verwendete Taiep-Mausmodell zeigt einen abnormalen Mikrotubuli-Gehalt in den Oligodendrozyten und rekapituliert die meisten sensomotorischen Symptome von H-ABC-Patienten¹⁷. Das Protokoll erklärt, wie Strukturen wie das Corpus callosum und das Kleinhirn, die normalerweise stark myelinisiert sind und die sowohl bei menschlichen Patienten als auch bei der Taiep-Ratte ¹⁹ stark betroffen sind, abgebildet werden können, um die Unterschiede in den SH-Signalen zwischen gesundem und mutiertem Gewebe hervorzuheben.